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蜡梅Chimonanthus praecox (L.)Link转录因子1R-Myb1基因的克隆与功能初探

罗莉莉  
【摘要】: 腊梅(Chimonanthus praecox(L.)Link),英名winter sweet,腊梅科(Calycanthaceae)腊梅属(Chimonanthus Lindi.)因其在腊月开花故又称腊梅。根据腊梅的生长习性,以“耐寒、耐旱、耐剪”“三耐”而著称,因此有“冻不坏、旱不死、不缺枝”“三不”的说法。转录因子又称反式作用因子(Transcription factor),是一类通过DNA序列特异结合及蛋白—蛋白相互作用以激活或抑制靶基因的转录并提高或降低靶基因mRNA的水平来调节靶基因表达的一类基因。转录因子功能多样,调控植物器官的发育、生长、分化等生长发育过程;与此同时,很多转录因子通过蛋白质—蛋白质的、基因—蛋白质的相互作用参与抗逆性的信号传导。腊梅在各种逆境条件下能够生长旺盛,可推测其在非生物胁迫条件下,有很多转录因子调控了各种环境的一系列基因的表达。 从国内外来看,在腊梅研究方面,国内研究具有明显优势,重点对腊梅科植物的生物学特性、野生群落结构及分布的调查、种属一级的分类、繁殖以及花和叶生物化学等方面的许多重要问题进行了研究,并取得了不同程度的研究成果。但是,相对于其他著名花卉,腊梅的研究、利用还存在较大差距。特别是在分子生物学方面的研究还未起步,尤其对转录因子的抗逆行分析研究报道很少,而且对于只含有一个结构域的MYB家族的研究几乎是空白,作为特色基因资源或育种种质资源的研究利用还未见报道。 本实验在构建蜡梅花cDNA文库及EST分析的基础上,通过随机克隆测序,克隆了1个蜡梅MYB家族类的转录因子的cDNA基因,命名为1R-Myb1(GenBank accession number:EU116031)。1R-Myb1 cDNA全长1327bp,无内含子的存在,推测的编码蛋白1R-MYB1包含318个氨基酸。1R-MYB1是含有单一结构域的MYB家族基因,1R-MYB1蛋白N端含有一个sant domain保守结构域和HTH结构域,H-T-H motif结构域用于蛋白质—DNA序列相结合的,而sant domain用于蛋白质—蛋白质相互作用的结构域。磷酸化位点预测表明,有12个Ser磷酸化位点,3个Thr磷酸化位点,4个Tyr磷酸化位点;二级结构预测,1R-MYB1蛋白有25.16%的α螺旋,14.47%的延伸链,8.49%的β转角(βturn)和51.89%的随机卷曲。序列比较分析表明1R-Myb1是首次从蜡梅中克隆到的含有一个sant domain的MYB家族转录因子,与其同源性较高的基因分别来自于长春花、大豆、拟南芥的基因均与逆境代谢相关,与此推测1R-Myb1也与逆境代谢途径相关。RT-PCR分析表明,该基因在茎、叶、雄蕊、雌蕊有表达, 对蜡梅幼苗进行高温、低温、干旱、高盐、ABA胁迫处理,分别在2h、10h、24h取样提取RNA进行RT-PCR分析表明,该基因的表达在这三个时段内均有变化,呈减弱或在这三个时段内的某个时段开始恢复(与对照相比),说明该基因的表达与胁迫相关,在整体趋势呈减弱状态,推测转录因子1R-Myb1基因的表达与胁迫呈负相关,推测该基因是逆境代谢途径的关闭基因。而植物的抗逆代谢途径一般有三种,茉莉酸甲酯途径、水杨酸途径、脱落酸即ABA代谢途径,1R-Myb1基因与抗逆相关,可能是参与这三个途径的信号传导的某一种途径,分析得出其主要调控ABA传导途径,与此同时也参与其他途径,并以此为辅。构建植物表达载体,转化烟草,获得转基因烟草,进一步利用酵母双杂交寻找转录因子的下游基因的信号传导,为蜡梅抗逆研究奠定了基础。


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