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黄花蒿杀螨物质活性追踪及杀螨作用机理研究

张永强  
【摘要】: 植物在生长发育过程中,其光合作用和呼吸作用都是极为复杂的生理生化反应,会产生大量的代谢产物。这些产物具有的某种生理活性或用途,一直在被人们加以利用。植物成分及其代谢产物是天然药物的重要组成部分。人类在长期与疾病作斗争的过程中,以身试药,日积月累,对天然药物主要是植物药的应用积累了丰富的经验。中草药在人们控制疾病的过程中发挥了十分重要的作用,而且这些中草药大多数对于控制害虫也有一定的效果。黄花蒿(Artemisia annua L.)是一年生草本植物,为菊科蒿属植物,是中药青蒿的主要药源植物。株高约40-150cm,全生育期210d左右。黄花蒿在我国各地都有分布,生态适应性广,常生于山坡、林地、荒地。药农常于秋季花盛开时割取地上部分,除去老茎,晾干即可药用。黄花蒿药用价值很高,其主要活性成分是青蒿素,主治疟疾、结核病潮热,还能治中暑、皮肤瘙痒、荨麻疹、脂溢性皮炎等病症。青蒿素的衍生物可生产很多系列药品。由于重庆独特的自然地理因素适合黄花蒿的生长,重庆是全球黄花蒿种植的最大基地,有“黄花蒿故乡”的美誉,开发黄花蒿的优势得天独厚。 螨类,特别是植食性害螨,是严重为害我国农业生产的一类重要生物。它具有个体小、繁殖快、种群密度高、为害重等特点,可为害150余种作物。据不完全统计,我国每年用于柑橘、苹果、梨、桃、棉花、蔬菜、小麦、茶8类主要作物的杀螨剂防治费用就达90多亿元,而且随着螨类对化学药剂抗药性的逐年增加,防治费用也逐年加大。面对化学农药所产生的种种问题和杀虫杀螨剂常规研发途径的日益艰难,从生物活性天然产物中开发新的药剂已经成为国内外农药研究开发的热点问题之一。 本研究得到了国家自然科学基金(30671392)和重庆市科技攻关项目(2001-6599)的资助。本文主要研究了生长期在4月、5月、6月、7月和9月的黄花蒿根、茎、叶等不同部位的多种溶剂提取物的提取率;各种提取物对朱砂叶螨,柑橘全爪螨和酢浆草岩螨的生物活性;7月份黄花蒿提取物对豇豆种子胚根和胚轴的生长抑制作用;追踪分离到黄花蒿杀螨活性物质东莨菪内酯;研究了东莨菪内酯对朱砂叶螨SOD,CAT,POD,GST,CarE,AChE,MAO,Ca~(2+)-ATP等酶系比活力的影响。通过近3年的研究,获得了如下结果: 1黄花蒿有机物质的提取率 利用一系列溶剂对4月份采集的黄花蒿植株的根、茎、叶分别进行常规室温浸提、恒温浸提、室温搅拌提取和微波辅助萃取。4种提取方法对提取率的影响差异不大,从经济角度综合比较,采用室温搅拌提取较为适宜。 对4、5、6、7、9月份采集的黄花蒿根、茎、叶分别用不同溶剂进行平行提取和顺序提取,从提取率来看,平行提取的提取率普遍高于顺序提取;无论是平行或是顺序提取,水的提取率都是最高的(根茎叶提取率均高于其他溶剂的提取率),其次是丙酮,再次是乙醇。从不同的植株部位看,叶的提取率相对较高,其次是根,而茎最低。 2植物源杀螨剂的生物活性测定方法的选择与评价 生物测定方法对农药的研究与开发具有重要意义。基于此本研究首先从剂量大小、测定效果、测定效率和成本等方面对玻片毛细管法、玻片浸渍法、叶片浸渍法等三种方法进行了比较。结果表明玻片毛细管法测定的结果与FAO推荐使用的玻片浸渍法无明显差异,且其用药量大幅度下降,效率更高,适合于植物源杀螨剂的生物测定。 3黄花蒿提取物的杀螨活性 3.1对朱砂叶螨的生物活性 为了明确黄花蒿杀螨活性物质的最佳提取工艺,选择合适的溶剂和最佳的植株部位;明确黄花蒿杀螨活性物质的动态分布状态,从而为综合开发利用黄花蒿提供科学依据。将分别采集于4、5、6、7和9月5个月份的黄花蒿植株,分成根、茎、叶3个部分,采用石油醚(30~60℃)、石油醚(60~90℃)、乙醇、丙酮和水溶剂的平行和顺序提取方法,共计获得135种提取物,用玻片毛细管法测定其对朱砂叶螨的生物活性。在杀螨活性方面,黄花蒿的杀螨活性随植株的生长呈增加的趋势,总体表现为7月份>6月份>5月份>4月份,但9月份的杀螨活性与7月份相比有所下降。5个月份的黄花蒿叶丙酮平行提取物的活性都比相同月份的其他提取物强,药剂浓度为5mg·mL~(-1)时,处理朱砂叶螨48h的校正死亡率介于74%~100%之间。黄花蒿不同月份叶的丙酮平行提取物对朱砂叶螨的LC_(50)随植物材料的采集时间不同呈规律性变化,4月份、5月份、6月份、7月份和9月份黄花蒿叶的丙酮平行提取物对朱砂叶螨处理48h,LC_(50)分别为1.3817,0.9443,0.8376,0.4341和0.5986mg·mL~(-1)。 3.2对柑橘全爪螨的生物活性 对采自于6月份的黄花蒿根茎叶不同溶剂提取物对柑橘全爪螨的生物活性测定结果表明:在同等条件下,叶提取物中除石油醚Ⅱ顺序提取物和水顺序提取物外,其他提取物的生物活性均比根和茎的提取物活性有明显的提高。其中叶丙酮平行提取物对柑橘全爪螨在5mg·mL~(-1)处理48h后生物活性最高,校正死亡率为88.84%,而石油醚Ⅱ平行提取物在相同条件下对柑橘全爪螨的校正死亡率亦达84.27%。 7月份黄花蒿叶的不同溶剂提取物对柑橘全爪螨的生物活性亦明显高于根和茎的活性。其中叶的丙酮平行提取物活性最高,5mg·mL~(-1)处理48h后,对柑橘全爪螨的校正死亡率达100%。黄花蒿7月份叶丙酮平行提取物对柑橘全爪螨的生物活性明显高于6月份,对柑橘全爪螨处理48h后,7月份的LC_(50)(0.4222mg·mL~(-1))仅为6月份(0.9489mg·mL~(-1))的44%。 3.3对酢浆草岩螨的生物活性 黄花蒿6月份根、茎、叶不同溶剂的提取物对酢浆草岩螨的活性普遍不高。采集于7月份的黄花蒿植株的不同部位,采用极性不同的几种溶剂,用平行和顺序提取的方法获得的提取物对酢浆草岩螨表现出优越于6月份的生物活性。其中7月份叶的丙酮平行提取物生物活性最高,处理48h,对酢浆草岩螨的校正死亡率为95.00%。 7月份黄花蒿叶丙酮平行提取物对酢浆草岩螨处理48h,其LC_(50)是0.4715mg·mL~(-1),而6月份的为0.9083mg·mL~(-1)。 4 7月份黄花蒿提取物对豇豆种子的植物毒性 前面已经证实了黄花蒿7月份植株总体上对朱砂叶螨、柑橘全爪螨和酢浆草岩螨都具有较强的杀螨活性,为了考察提取物的植物毒性作用,研究了7月份黄花蒿植株根、茎、叶不同溶剂的平行和顺序提取物对叶螨类主要寄主植物之—豇豆的种子发芽率,种子胚根、胚轴的生长抑制情况。结果表明:7月份黄花蒿根、茎、叶不同溶剂的平行和顺序提取物对豇豆种子发芽的影响存在一定的差异。其中茎的乙醇顺序提取物对豇豆种子发芽率的影响最大,表现出明显抑制作用,发芽率仅为23.81%,此外叶的丙酮顺序提取物对豇豆种子发芽率的影响也较大,发芽率为40.48%,而叶的丙酮平行提取物对豇豆种子发芽率影响甚微。7月份黄花蒿根、茎、叶的不同溶剂提取物对豇豆种子胚根、胚轴的生长抑制作用较弱;有些还表现出刺激生长作用。 5黄花蒿杀螨活性物质追踪分离 采用生物活性追踪法,测定了黄花蒿7月份叶的丙酮平行提取物柱层析所得不同组分对朱砂叶螨的生物活性。在最终分离出的20种组分中,组分17的杀螨活性最高,组分18和8次之。组分17,18和8的LC_(50)(48h)分别为0.1675,0.4368和0.3753mg·mL~(-1),其中组分17的活性相对于7月叶丙酮提取物而言提高大约2.6倍。 也测定了黄花蒿7月份叶的丙酮平行提取物柱层析所得的不同组分对柑橘全爪螨的杀螨活性,其中组分、17的杀螨活性最高,处理48h后,校正死亡率达到96.65%,与其他组分的杀螨活性存在显著差异。 同样测定了柱层析最终分离出的20种组分对酢浆草岩螨的生物活性,其中组分19的杀螨活性最高,2.5mg·mL~(-1)浓度下,处理48h后的校正死亡率达到69.28%。 而综合有效含量和生物活性两个因素考虑,组分17最具研究价值。因此对组分17进行了进一步的分离纯化,选择朱砂叶螨做为进一步活性追踪的供试螨类。组分17中含有三个主要的成分,其中17-3占的比例最高为77.64%,17-1次之,为16.21%,17-2所占比例最小,仅为5.31%。三种成分进行TLC分析,经碘显色,可见的斑点数均为一个,且无拖尾。三种成分对朱砂叶螨的生物活性测定结果表明,17-3具有较强的杀螨活性,处理48h,对朱砂叶螨的LC_(50)为0.1014mg·mL~(-1),与整个第17组分对朱砂叶螨的LC_(50)为0.1675mg·mL~(-1)相比,毒力有所提高。 对17-3进行重结晶实验,在一定的温度下分别用无水甲醇、丙酮、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁烷溶解,重结晶,放冰箱冷却静置得到晶体,从中选出最佳的温度和溶剂。结果表明,根据结晶晶形以及溶剂用量判断,以乙酸乙酯为溶剂在55℃下结晶的效果最好。随后用HPLC-MS、~1H-NMR、IR等手段,确定纯化后的17-3为东莨菪内酯scopoletin,分子量:192.17,分子式:C_(10)H_8O_4。生物测定结果表明,对17-3进行重结晶纯化所得的东莨菪内酯对朱砂叶螨的生物活性较17-3有所增强。 6东莨菪内酯对朱砂叶螨的致死机理 朱砂叶螨受东莨菪内酯处理后,其超氧化物歧化酶(SOD)活性随着处理时间的延长表现出先升高再下降的趋势,但整体上表现为受药剂处理的酶活性低于对照。所有处理测得的过氧化氢酶(CAT)活性均有所提高,表明朱砂叶螨在受到东莨菪内酯处理后,CAT在一定程度上被激活。POD活性均较对照有明显下降,且随药剂浓度的变化而略有差异。总体表现为朱砂叶螨受到东莨菪内酯处理后,其体内的POD活性受到了明显的抑制。 朱砂叶螨在受到东莨菪内酯处理后谷胱甘肽-S-转移酶(GST)活力有所提高。随着处理时间的延长,处理组的酶活力都高于对照组,但整体上表现出下降的趋势,尤其是在处理48h后,酶活力均降至最低水平。东莨菪内酯激活了朱砂叶螨羧酸酯酶(CarE)的活性,且随着药剂浓度的增加酶活性被激活的程度也随之增大。而乙酰胆碱酯酶(AChE)活性表现出先上升再下降的趋势。Ca~(2+)-ATP酶的活力有不同程度的下降,表明东莨菪内酯对Ca~(2+)-ATP酶有一定的抑制作用。就单胺氧化酶(MAO)的活性而言,处理组与对照组的MAO的活力变化趋势接近,但均低于对照组,因此,MAO受到了一定程度的抑制。


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