野桑蚕等酚氧化酶的生化特性、基因克隆、表达及功能研究

【摘要】： 酚氧化酶(Phenol Oxidase，简称PO，在哺乳动物中称为酪氨酸酶)广泛存在于生物体内，它是昆虫生命活动中的重要调节酶，在昆虫的变态发育和免疫系统中起着重要的作用。酚氧化酶催化完成的“醌鞣化”作用可以促进昆虫表皮的硬化与黑化，这个过程对于昆虫的成活至关重要。酚氧化酶抑制剂理论可以为开发以该酶为靶标的新型害虫控制剂提供重要的线索。野桑蚕和桑尺蠖是桑园的主要害虫，终年危害桑树，常爆发成灾。采用化学方法防治，存在害虫抗药性增强和污染环境等问题。因此，开发对环境友好和专一的酶抑制剂有着广阔的应用前景。本研究以鳞翅目的害虫野桑蚕和桑尺蠖以及典型的模式生物家蚕为试验材料，通过对野桑蚕和桑尺蠖酚氧化酶的分离纯化、生化特性、抑制动力学以及对野桑蚕酚氧化酶原基因克隆、生物信息学分析、半定量RT-PCR表达谱和家蚕酚氧化酶原基因表达谱差异比较及RNAi等的研究和分析，主要获得以下结果： 1．采用0-40％饱和度的硫酸铵盐析沉淀对野桑蚕酚氧化酶进行了分离纯化，结果酶活力提高了2．33倍，然后用Sephadex G-100凝胶过滤层析技术对野桑蚕酚氧化酶进行了纯化，经两步纯化后，酚氧化酶活力提高了57．14倍。 2．采用0-80％饱和度的硫酸铵盐析沉淀对桑尺蠖酚氧化酶进行了分离纯化，结果酶活力提高了1．55倍，然后用Sephadex G-100凝胶过滤层析技术对桑尺蠖酚氧化酶进行了纯化，经两步纯化后，酚氧化酶活力提高了6．28倍。 3．野桑蚕酚氧化酶的最适pH值为7．0，在33℃-43℃的范围内，酶活性几乎无变化，其最适温度为37℃左右。70℃时保温15min，酶活力还有原活力的28％。 4．桑尺蠖酚氧化酶的最适pH值为7．0，最适温度为37℃。70℃时保温15min，酶活力还有原活力的12％。 5．以3种结构相似的多元酚作为底物研究野桑蚕和桑尺蠖酚氧化酶底物专一性的结果表明，野桑蚕酚氧化酶对邻苯二酚的亲和力高于L-多巴，对焦性没食子酸的亲和力最低，该酶对邻苯二酚、L-多巴和焦性没食子酸的K_m值分别为2．06mmol／L、3．17mmol／L和3．39mmol／L。而桑尺蠖酚氧化酶对L-多巴的亲和力高于邻苯二酚，对焦性没食子酸的亲和力最低，该酶对L-多巴、邻苯二酚和焦性没食子酸的K_m值分别为4．30mmol／L、6．82mmol／L和9．64mmol／L。另外，还分别研究了反应时间、底物浓度、酶浓度与反应速率的关系。 6．研究EDTA-2Na和金属离子对野桑蚕和桑尺蠖酚氧化酶活力的影响，结果表明Mg~(2+)、Ca~(2+)和Zn~(2+)对野桑蚕酚氧化酶有较强的激活作用，EDTA-2Na和Cu~(2+)能强烈地抑制该酶的活性。而Mg~(2+)、Ca~(2+)对桑尺蠖酚氧化酶有较强的激活作用，EDTA-2Na、Zn~(2+)和Cu~(2+)对该酶有较强的抑制作用。 7．研究有机溶剂和多种氧化酶抑制剂对野桑蚕和桑尺蠖酚氧化酶活力的影响，结果表明甲醇、乙醇、丙三醇、异丙醇和多种氧化酶抑制剂对酶活力均有不同程度的抑制作用，且具有浓度依赖性。 8．用槲皮素作抑制剂，研究其对野桑蚕和桑尺蠖酚氧化酶的抑制动力学。结果表明，槲皮素是野桑蚕和桑尺蠖酚氧化酶的竞争性抑制剂，其抑制常数(K_i)分别为44．61μmol／L和20．5μmol／L。 9．用硫脲作抑制剂，研究其对野桑蚕和桑尺蠖酚氧化酶的抑制动力学。结果表明，硫脲是野桑蚕和桑尺蠖酚氧化酶的非竞争性抑制剂，其抑制常数(K_i)分别为0．07μmol／L和0．18mmol／L。 10．通过RT-PCR技术，克隆了野桑蚕酚氧化酶原基因PPO1和PPO2，序列已在GenBank上登录，登录号分别为EU569724和EU047703，基因的cDNA长度分别为2086bp和2134 bp。其开放阅读框长度分别为2058 bp和2082 bp，分别编码685和693个氨基酸残基。PPO1和PPO2基因序列均具有与家蚕等其它鳞翅目昆虫PPO基因相似的丝氨酸蛋白酶酶切位点、2个高度保守的铜离子结合位点、位于铜离子结合位点内的6个保守的组氨酸残基及5个可能的N连接糖基化位点，无信号肽序列。在线工具预测野桑蚕PPO1和PPO2基因编码蛋白质的等电点和分子量分别为pI／Mw：6．28／78．703KDa和pI／Mw：5．62／80．075KDa。同源序列的多序列比对结果显示野桑蚕和家蚕PPO1和PPO2基因及其编码的氨基酸序列同源性很高，野桑蚕和家蚕PPO1基因只有14个碱基的差异，5个氨基酸的不同；PPO2基因只有21个碱基的差异，3个氨基酸的不同。在家蚕基因组中的BLASTN程序检索，发现两基因在基因组中均只有一个拷贝，cDNA与基因组序列比对，发现PPO1具有13个外显子、12个内含子；PPO2具有11个外显子，10个内含子，且外显子／内含子边界都符合GT-AG规则。系统进化树表明野桑蚕和家蚕的亲缘关系最近，与微生物和哺乳动物等的亲缘关系最远。这进一步说明了家蚕起源于野桑蚕。 11．通过对PPO1和PPO2基因在野桑蚕和家蚕中的半定量RT-PCR表达谱差异比较分析表明PPO1和PPO2基因在野桑蚕和家蚕的不同组织及不同发育时期中的表达是有差异的，且基因表达的差异较大。这说明了PPO1和PPO2基因在野桑蚕和家蚕的生命活动中行使着不同的功能。 12．本研究合成了野桑蚕PPO2基因部分编码区对应的dsRNA，通过注射上蔟前一天的野桑蚕，到化蛹第6天观察到蛹表皮的发育受到影响(表皮色淡柔软)，RT-PCR检测到了PPO2mRNA的减少，Northem blot未检测到信号，证明在蛹变态期发生了特异的RNAi现象。干涉结果揭示了野桑蚕PPO2基因与蛹表皮的硬化有关。