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肉苁蓉多糖脂质体制备及对鸡新城疫苗免疫效果影响的研究

李科  
【摘要】: 肉苁蓉多糖(Polysaccharide of Cistanche deserticola,CDPS)是从植物肉苁蓉中提取的一类高分子活性物质,其可增强巨噬细胞吞噬功能、提高血清溶血素值,同时还具有单独或协同ConA、PHA促进小鼠胸腺淋巴细胞增殖、脾脏淋巴细胞分泌IL-2的能力,显示出广泛的免疫调节功能。但将CDPS作为一种免疫增强剂直接用于兽医临床,存在着体内代谢较快、作用时间较短、使用成本较高等不足之处。脂质体作为一种人工合成的药物靶向载体,对所载药物具有缓释、靶向沉积于网状内皮系统(RES)的特性,能延长药物的作用时间、提高生物利用效率及药物定向作用于免疫系统的强度。本课题利用脂质体包封技术,将CDPS制备成一种新型的免疫增强剂即肉苁蓉多糖脂质体,通过均匀试验设计原理,筛选出制备CDPS脂质体的最佳工艺参数,并以目前仍严重危害养鸡业发展的病毒性传染病鸡新城疫(NewcastleDisease,ND)为研究对象,探讨CDPS脂质体对ND疫苗免疫效果的影响,并从细胞免疫、体液免疫、免疫调节因子(IL-2、IL-4、IFN-γ)活性变化方面,研究CDPS脂质体增强肉鸡免疫机能的可能机制。主要研究内容及结果如下: 1.三种方法提取肉苁蓉多糖的比较研究 分别采用水提醇沉法、超声法、超声结合水提法提取肉苁蓉多糖,胰蛋白酶-Sevag法除去蛋白,利用molish鉴别反应、碘-碘化钾反应、多糖水解反应鉴定提取物是否主要为多糖类物质,葸酮-硫酸比色法测定提取物中多糖的含量。结果三种方法的提取物主要均为多糖,其得率分别为1.93%、2.28%、6.06%,纯度分别为65.7%、74.3%、81.2%,说明超声结合水提法提取肉苁蓉多糖效果最好。 2.均匀试验设计法优化肉苁蓉多糖脂质体制备工艺研究 采用逆向蒸发法制备CDPS脂质体,透析处理后利用蒽酮-硫酸比色法测定包封率,并以其为CDPS脂质体质量的主要评价指标。根据均匀试验设计原理,按照U*_6(6~4)均匀设计表设计试验方案,探讨大豆卵磷脂与氯仿的比例、胆固醇与大豆卵磷脂的比例、肉苁蓉多糖与大豆卵磷脂的比例、磷酸盐缓冲液PH值4个因素(每个因素6水平)对包封率的影响。结果,四个因素分别为7%、1∶5、1∶14、6.6时,CDPS脂质体平均包封率最高,达68.13%,RSD值仅为2.51%,且在此条件下制备的CDPS脂质体在4℃、避光保存120天内,PH值基本稳定,虽有分层现象出现,但保存120天时包封率仍达50.15%。 3.肉苁蓉多糖脂质体对鸡ND苗免疫效果的影响研究 选择20日龄健康罗曼肉公鸡60只随机分为4组,即CDPS脂质体(Ⅰ)、CDPS(Ⅱ)、脂质体(Ⅲ)和生理盐水(Ⅳ)组,当试验鸡血清HI抗体效价低于3log2时肌肉注射免疫ND苗,同时,Ⅰ组肌肉注射5mg/ml的CDPS脂质体(500μl/只)、Ⅱ组肌肉注射50mg/ml的CDPS(200μl/只,CDPS含量为Ⅰ组的4倍)、Ⅲ组肌肉注射空白脂质体(500μl/只)、Ⅳ组肌肉注射生理盐水(500μl/只)。分别于免疫前及免疫后第10、20、30天时,翅静脉采血收集血清,测定其HI抗体效价及IgG含量,同时对免疫后30天时所收集血清进行鸡胚中和保护试验。结果免疫后10天时,试验组及对照组HI抗体效价明显升高;免疫后20天时,Ⅰ组极显著高于生理盐水对照组(P<0.01),略高于Ⅱ、Ⅲ组;免疫后30天时,四组血清HI抗体效价均呈降低趋势,但Ⅰ组显著高于Ⅱ组和Ⅳ组(P<0.05),与空白脂质体组无显著差异(P>0.05);免疫鸡血清IgG含量变化趋势显示:免疫后10天时,Ⅰ组IgG水平较其它组略高,但各组间无显著差异(P>0.05),Ⅰ组免疫后第20、30天,Ⅱ、Ⅲ组免疫后第30天时,血清IgG水平均极显著地高于对照组(P<0.01),免疫后30天时,Ⅰ组还极显著高于CDPS、空白脂质体组(P<0.01),Ⅰ组免疫后10天至30天时,血清IgG水平呈逐渐升高趋势,其它组免疫后10天至20天时,血清IgG水平呈升高趋势,但至30天时,血清IgG水平开始下降;中和试验结果显示:CDPS脂质体组鸡胚死亡率明显低于CDPS、空白脂质体及生理盐水组,中和指数以CDPS脂质体组最高。结果说明,CDPS脂质体对肉鸡免疫机能的促进作用最强。 4.肉苁蓉多糖脂质体对鸡免疫ND苗后血液中T淋巴细胞、IL、IFN活性的影响研究 在对肉鸡进行ND苗抗体检测的同时,于免疫后15天,每组随机取6羽,翅静脉无菌采集抗凝血,采用酸性α-乙酸萘酯酶染色试验(ANAE)和淋巴细胞转化试验(MTT法)分别测定T淋巴细胞ANAE阳性率及增殖活性。免疫后20天时,每组随机取8羽翅静脉采血分离血清,采用ELISA方法测定血清中细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ的含量。结果表明,淋巴细胞转化率在四组间无显著差异(P>0.05),淋巴细胞ANAE阳性率在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组间无显著差异(P>0.05),但Ⅰ、Ⅱ组显著高于对照组(P<0.05);IL-2含量以CDPS脂质体组和脂质体组较高,均极显著高于CDPS组和生理盐水对照组(P<0.01),CDPS脂质体组IL-4含量极显著高于其它三组(P<0.01),IFN-γ的含量在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组间无显著差异(P>0.05),但CDPS脂质体组显著高于生理盐水组(P<0.05)。以上结果说明:肉苁蓉多糖脂质体对肉鸡免疫机能的促进作用与血清中T淋巴细胞、IFN-γ、IL-4、IL-2的活性变化相关。


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