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裳卷蛾变形孢虫(Vairimorpha ceraces sp.nov.)SSUrRNA核心序列的克隆与分析

马露芸  
【摘要】: 微孢子虫是一类广泛分布的、专营细胞内寄生生活的、无线粒体的单细胞真核生物,能寄生无脊椎动物和脊椎动物,是经济昆虫、鱼类、兔类、皮毛动物、啮齿类及灵长类动物的致命病原。微孢子虫种类繁多,已发现的微孢子虫种类超过1300种,分别划入150多个属。 微孢子虫一般被认为是与生物进化有关的最原始的单细胞真核生物,其SSUrRNA的一级结构的保守性表现在所有种系中,比编码蛋白质的基因保守100倍以上,且碱基长度适中,碱基变化的积累以一种类似计时器的方式进行,因此,SSUrRNA在生物进化和系统演化研究中是一个良好的分子指标,已被广泛应用于生物的进化分析和分类。将分子生物学等方面的信息与以形态、生活史等为主的微孢子虫生物学分类系统有机地结合,有助于构建更有价值的微孢子虫分类系统。 裳卷蛾变形孢虫分离于野外昆虫龙眼裳卷蛾Cerace stipatana Walker,可感染家蚕,最初通过对其形态大小、感染性、超微结构以及血清学反应的初步研究后将其定为Nosema属。后来,研究发现该微孢子虫在孢子生殖的过程中既有二孢子形态又有八孢子形态,而且八孢子形态为数众多,根据Sprague提出的微孢子虫生物学分类系统,将它归于布雷孢虫科(Burenellidae)、变形孢虫属(Vairimorpha)。进一步的研究和查新后,确定该微孢子虫为新种,根据其寄主名称将其命名为裳卷蛾变形孢虫Vairimorpha ceraces sp.nov.。 目前对裳卷蛾变形孢虫的形态学、超微结构、病理学、生物学特征进行了研究,本实验通过对其SSUrRNA核心保守序列的克隆和系统进化分析,希望能为它的分类和进化提供分子生物学方面的依据。 1裳卷蛾变形孢虫(Vairimorpha ceraces sp.nov.)SSUrRNA核心序列的克隆 (1)采用常规碳酸钠法、TEK法和改良CTAB法制备DNA,三种方法的效果都比较理想。但是在实验中通过比较发现,孢子浓度越高、孢子越新鲜,抽提处理过程中时间相对较短,提取的基因组DNA越多,完整性越好。这可能与新鲜孢子致病力强、发芽率高有关。 (2)利用微孢子虫SSUrRNA基因共有的保守序列设计了裳卷蛾变形孢虫SSUrRNA核心序列的引物,经过PCR扩增得到一条长度约为1200bp的目的条带。 (3)采用T-A克隆法对裳卷蛾变形孢虫SSUrRNA核心序列进行了克隆,对阳性克隆进行了双酶切鉴定和PCR检验。通过测序,去除上下游引物,得到裳卷蛾变形孢虫的SSUrRNA核心序列共1228bp,具有43种常见酶的119个酶切位点。其GC含量为34.69%,ssDNA分子量是37.01KD,裳卷蛾变形孢虫SSUrRNA核心序列在GenBank中的登录号为gi161137618|EU267796。 2裳卷蛾变形孢虫(Vairimorpha ceraces sp.nov.)SSUrRNA核心序列的相似性分析 通过BLAST比对,与裳卷蛾变形孢虫SSUrRNA核心序列相似的序列基本都来自于Vairimorpha属和Nosema属。它与Vairimorpha属的模式种Vairimorpha necatrix的相似性仅有71%,但与一些分离于鳞翅目昆虫的Vairimorpha属和Nosema属微孢虫具有99%的高相似性。 3裳卷蛾变形孢虫(Vairimorpha ceraces sp.nov.)SSUrRNA核心序列的同源性分析 利用ClustalX1.83和MEGA3.1软件构建了Vairimorpha属和Nosema属部分SSUrRNA序列的系统发育进化树。 在构建的系统发育进化树中,Vairimorpha属和Nosema属不能很清晰地分成两个类群,而是出现交叉聚类的现象。裳卷蛾变形孢虫与分离于鳞翅目昆虫的Vairimorpha属和Nosema属部分序列聚为一类,它们的遗传距离为0.00~0.01。这种现象在用SSUrRNA、SSUrDNA、LSUrRNA进行Vairimorpha属和Nosema属的进化分析时不断出现。这可能与Vairimorpha属和Nosema属之间本来就具有很近的亲缘关系有关,也可能与微孢子虫细胞内寄生生长受到宿主基因组控制产生一些协同进化有关。 与裳卷蛾变形孢虫分支最近的还是Vairimorpha sp.Germany,表明它们的同源性仍然是最高的。 4裳卷蛾变形孢虫的分类地位 更有价值的微孢子分类系统不仅包括其生物学特征,也与现代分子生物学和生物信息学密不可分,两者相辅相成。裳卷蛾变形孢虫(Vairimorpha ceraces sp.nov.)在孢子生殖时存在着二孢子形态和八孢子形态,本实验又对其SSUrRNA核心序列进行了克隆和进化分析,根据Sprague的微孢子虫分类系统和Canning et al.的建议,裳卷蛾变形孢虫确是Vairimorpha属的成员,也许归入Nosematidae科更为合适。


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1 马露芸;裳卷蛾变形孢虫(Vairimorpha ceraces sp.nov.)SSUrRNA核心序列的克隆与分析[D];西南大学;2008年
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