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瓦氏黄颡鱼雌性蛋白的纯化、性质鉴定及酶联免疫吸附检测方法的建立

李育培  
【摘要】: 腹腔注射17β-雌二醇(E_2),使瓦氏黄颡鱼(P.vachelli)雄鱼在7 d内产生卵黄蛋白原(Vtg)。采用凝胶过滤和离子交换两步层析法、Mg~(2+)—EDTA选择性沉淀和凝胶过滤层析两步法、Mg~(2+)—EDTA选择性沉淀和电洗脱两步法等三种技术,从E_2诱导的雄性瓦氏黄颡鱼血浆中分离、纯化Vtg,采用糖、磷、脂蛋白染色技术证明分离、纯化的蛋白为Vtg,该Vtg在非变性条件下分子量约为240kDa,在SDS变性条件下分子量约为143kDa。纯化的瓦氏黄颡鱼Vtg经检测显示可能含有类胡萝卜素,但没有二硫键,对热相对稳定。利用纯化的瓦氏黄颡鱼Vtg,制备了兔抗瓦氏黄颡鱼Vtg多克隆抗血清。用双向免疫扩散法测得抗血清的纯度较高,效价为1:32;Western blotting检测显示抗血清的特异性较好。以瓦氏黄颡鱼Vtg多克隆抗血清为抗体,以纯化的瓦氏黄颡鱼Vtg为抗原,建立了间接酶联免疫吸附反应(ELISA)方法检测瓦氏黄颡鱼体内Vtg的含量,标准曲线线性部分的线性方程为y=0.099x+0.4529(R~2=0.9327),该方法检测的灵敏度为15.6ng/ml,工作范围为31.2—4000ng/ml,在此范围内,标准曲线具有良好的线性。 采用凝胶过滤和离子交换两种层析技术,从瓦氏黄颡鱼Ⅳ期卵巢粗体液中分离、纯化Lv,采用糖、磷、脂蛋白染色技术证明分离、纯化的蛋白为Lv,该Lv在非变性条件下分子量约为230kDa,在SDS变性条件下分子量约为106kDa。纯化的瓦氏黄颡鱼Lv经检测显示可能含有类胡箩卜素,但没有二硫键,对热相对稳定。利用纯化的瓦氏黄颡鱼Lv,制备了兔抗瓦氏黄颡鱼Lv多克隆抗血清。通过双向免疫扩散法测得Lv抗血清的效价为1:32,还发现Vtg和Lv之间有明显的免疫交叉反应,说明两者具有相同的免疫原性;Western blotting检测显示抗血清的特异性较好,并能特异性地识别Vtg。


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