温度和阿维菌素胁迫下朱砂叶螨Hsp70s基因表达研究

【摘要】： 朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)在我国分布广泛,是严重为害棉花、蔬菜等多种作物而又难于防治的一种害螨。该螨繁殖能力强,产卵力高,世代周期短,在短时间里能够迅速形成一定数量的种群,并且容易产生抗药性。 热激蛋白70(Hsp70)是热休克蛋白家族中最重要的一类家族成员,它具有“分子伴侣”、细胞保护、抗凋亡以及肿瘤免疫治疗等独特而复杂的生物学功能,对Hsp70研究已成为生命科学领域研究的热点之一。 本项研究通过RACE技术克隆获得4条朱砂叶螨Hsp70基因cDNA全长,并用Real-timeRT-PCR技术检测了分别经阿维菌素和不同温度胁迫后4条Hsp70基因在朱砂叶螨雌成螨体内的表达变化情况,从分子水平初步探讨了朱砂叶螨Hsp70基因的表达变化与其适应逆境胁迫之间的内在联系。本研究得到了国家自然科学基金(30600059)的资助,获得以下主要研究结果: (1)成功克隆出4条朱砂叶螨Hsp70基因cDNA全长序列,分别命名为TCHsp70-1、TCHsp70-2、TCHsp70-3和TCHsp70-4。TCHsp70-1核苷酸序列在GenBank中的登录号为EU679412,cDNA全长2446bp,包括1965bp的开放阅读框,起始密码子为ATG,终止密码子为TAA,编码655个氨基酸。其理论分子量为71.28 kDa,等电点(pI)为5.37;5′端非编码区长274bp,3′端非编码区长207bp,poly(A)加尾信号AATAAA位于poly(A)上游14bp处。TCHsp70-2核苷酸序列在GenBank中的登录号为EU679413,cDNA全长2305bp,包括2016bp的开放阅读框,起始密码子为ATG,终止密码子为TAG,编码672个氨基酸。其理论分子量为73.78 kDa,pI为5.26;5′端非编码区长189bp,3′端非编码区长97bp,poly(A)加尾信号AACAAA位于poly(A)上游27bp处。TCHsp70-3核苷酸序列在GenBank中的登录号为EU679414,cDNA全长2284 bp,包括1980 bp的开放阅读框,起始密码子为ATG,终止密码子为TAA,编码660个氨基酸。其理论分子量为71.86 kDa,pI为5.39;5′端非编码区长134 bp,3′端非编码区长165 bp,poly(A)加尾信号AATAAA位于poly(A)上游13 bp处。TCHsp70-4核苷酸序列在GenBank中的登录号为EU977182,cDNA全长2182 bp,包括1956 bp的开放阅读框,编码652个氨基酸。推测其理论分子量为70.9 kDa,pI为5.40;5′端非编码区长106 bp,3′端非编码区长117bp,poly(A)加尾信号AATAAA位于poly(A)上游14bp处。 (2)同源比对分析结果表明克隆获得的4条朱砂叶螨Hsp70基因与其它物种的Hsp70基因有很高的相似性,且都包含有Hsp70完整的典型基序(Motif),而且N端的保守性高于C端。克隆获得的4条Hsp70s之间的相似性最低为57.33%(TCHsp70-1与TCHsp70-2),最高为91.90%(TCHsp70-3与TCHsp70-4)。系统进化树显示TCHsp70-1、TCHsp70-3和TCHsp70-4属于细胞质Hsp70;TCHsp70-2属于内质网Hsp70。 (3)运用实时定量RT-PCR体系检测、比较了朱砂叶螨雌成螨受不同温度胁迫后4条Hsp70基因的表达情况。结果显示,TCHsp70-1经冷激(7℃、10℃)后的表达要显著高于热激(34℃、37℃)后的表达,说明该基因更倾向于响应冷激;TCHsp70-3热激(34℃、37℃)后的表达比冷激(7℃、10℃)后显著升高,说明该基因对热激更敏感;而TCHsp70-4热激(34℃、37℃)和冷激(7℃、10℃)后都大量表达,对冷热刺激都较敏感;经不同温度处理后TCHsp70-2的表达相对稳定,其表达量都显著低于TCHsp70-1、TCHsp70-3和TCHsp70-4;这些结果一方面揭示了TCHsp70s的表达模式受它们在细胞内所处位置的影响,另一方面说明4条TCHsp70,尤其是TCHsp70-1、TCHsp70-3和TCHsp70-4基因在介导朱砂叶螨的耐寒、耐热力中扮演着重要角色。 (4)运用实时定量RT-PCR体系检测、比较了敏感、阿维菌素抗性和37℃高温饲养3个品系的朱砂叶螨雌成螨体内4条Hsp70基因的表达情况,结果显示阿维菌素抗性品系和37℃高温饲养品系4条Hsp70基因的表达量都显著高于敏感品系(TCHsp70-1表达在敏感和阿维菌素抗性品系中差异不显著,TCHsp70-2在阿维菌素抗性和37℃高温饲养品系中差异不显著除外),而且37℃高温饲养品系表达量最高。这表明阿维菌素和高温胁迫,都能诱导朱砂叶螨Hsp70s表达增加,但高温的诱导作用更强:阿维菌素胁迫诱导朱砂叶螨Hsp70s表达增加,可能是阿维菌素抗性品系高温下具有适合度优势的重要原因之一。