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模式昆虫赤拟谷盗AChE的毒理学特性研究

安峰明  
【摘要】: 赤拟谷盗Tribolium castaneum是鞘翅目中重要的储粮害虫,其直接或间接危害储藏物造成了严重的经济损失。同时,赤拟谷盗也是一种通用的模式生物,在遗传学、免疫学等研究领域具有重要的地位。2008年,由全世界14个国家的64个科研小组组成的国际研究团体对赤拟谷盗进行了完整的基因组测序。结果表明,赤拟谷盗全基因组包括大约2亿个核苷酸,基因(或蛋白)数量大约有16000个。这为模式昆虫赤拟谷盗分子生态学、毒理学及功能基因组学等各个领域的研究带来了巨大的推动作用。 乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,ACHE;EC 3.1.1.7)是生物神经传导中的一种关键性酶,能够迅速水解兴奋性神经递质乙酰胆碱而保持神经突触传导的正常进行,是有机磷和氮基甲酸酯类杀虫剂的重要作用靶标。为了阐明赤拟谷盗AChE的毒理学特性,本研究在教育部新世纪优秀人才支持计划(NECT-04-0854)和国家自然科学基金(30570231)资助下,对赤拟谷盗AChE毒理学特性进行了较为系统的研究,获得了以下主要结果: 1七种杀虫剂对赤拟谷盗的毒力比较 采用药膜法测定了7种杀虫剂对赤拟谷盗成虫的急性致死作用。结果表明,这7种杀虫剂的LC_(50)各不相同,通过机率值-对数值之间的毒力回归方程的结果可知有机磷类杀虫剂对赤拟谷盗的杀虫效果较氨基甲酸酯类杀虫剂的效果好,其中乙基对氧磷的杀虫效果最好(LC_(50)=295.31±28.34 mg/L);阿维菌素也有很好的触杀作用;但氨基甲酸酯类杀虫剂丁硫克百威和涕灭威对赤拟谷盗成虫的触杀作用并不理想;因此,在进行实仓防治时,可以考虑选择以有机磷类杀虫剂为主、多种杀虫效果好的杀虫剂合理搭配使用,可达到对赤拟谷盗更好的防治效果。 2赤拟谷盗AChE的生化毒理学特性研究 2.1赤拟谷盗AChE活性比较研究 比较研究了赤拟谷盗体躯各部分AChE的活力。结果表明,赤拟谷盗头部AChE活力最高,胸部次之,腹部活力最低。当用比活力进行分析时,赤拟谷盗头部酶原蛋白的比活力仍然最高。充分说明赤拟谷盗头部酶原蛋白的活性最强,比活力最高。 K_m值和V_(max)值测定的结果表明,赤拟谷盗头部AChE对底物的亲和力最高,且其催化能力最强。因此,在对赤拟谷盗AChE性质进行研究时,其头部AChE最具代表性,其余部位可以根据实验需要加以选择。 2.2杀虫剂对AChE的离体抑制作用比较研究 本研究测定了乙基对氧磷、甲基内吸磷、乙基对氧磷、敌敌畏、毒扁豆碱、西维因、残杀威和丁硫克百威共8种抑制剂对赤拟谷盗AChE的抑制作用。研究发现有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂对赤拟谷盗头、胸、腹AChE均有一定的抑制作用,有机磷类杀虫剂对赤拟谷盗AChE的抑制作用更强。其中,乙基对氧磷、甲基内吸磷和甲基对氧磷的抑制作用较好,其抑制中浓度较其他有机磷类杀虫剂的抑制中浓度更低,氧化乐果和毒死蜱对赤拟谷盗头部AChE的离体抑制作用较弱。氨基甲酸酯类杀虫剂对赤拟谷盗头部的AChE也有一定的抑制作用,残杀威对AChE的抑制作用优于丁硫克百威,但它们的抑制中浓度均高于有机磷类杀虫剂的抑制中浓度。 3赤拟谷盗酯酶同工酶和蛋白质电泳图谱的研究 采用SDS-PAGE法,用考马斯亮蓝R250染色,对赤拟谷盗体躯各部分(头、胸、腹)总蛋白分别进行蛋白质电泳,图谱显示赤拟谷盗胸部的蛋白总量高于头部和腹部,头部蛋白含量最低,但其种类较多。 酯酶同工酶电泳结果表明赤拟谷盗头部、胸部和腹部的酯酶种类不同,酯酶同工酶分子量也相差较大,其中头部高分子量的谱带所占比例大于腹部,胸部酯酶同工酶高分子量的谱带最少;赤拟谷盗体内主要有2种酯酶同工酶EST1和EST2,EST1含量相对较高,即赤拟谷盗体内包含a-酯酶和β-酯酶,a-酯酶含量相对较多。4种杀虫剂对赤拟谷盗酯酶同工酶的抑制作用强度顺序依次为:对氧磷>毒死蜱>丁硫克百威>马拉硫磷;赤拟谷盗头部的酯酶同工酶对这4种杀虫剂均比较敏感。 4赤拟谷盗AChE基因的克隆及序列分析 采用cDNA末端快速扩增技术(RACE),克隆得到1682bp的基因序列(缺少3'端),该基因包括由151个核苷酸组成的5'-RACE末端序列和由1531 bp核苷酸组成的开放阅读框(ORF)。利用该氨基酸在NCBI站点进行序列分析,找到赤拟谷盗基因组计划所预测的AChE基因全长,寻找其对应的氨基酸序列位置,获得所对应的赤拟谷盗AChE基因3'-RACE末端,进而进行序列拼接及分析,从而预测得到2047 bp赤拟谷盗AChE基因全长。 将预测的赤拟谷盗AChE氨基酸序列提交到NCBI,进行核苷酸与蛋白质(BLASTP)同源性比对,发现该氨基酸序列与赤拟谷盗基因组计划预测的AChE的同源性最高,达到93%;与褐飞虱Nilaparvata lugens AChE的同源性达到73%,与黑尾叶蝉Nephotettix cincticeps AChE的同源性达到76%。 通过对赤拟谷盗、果蝇和电鳐AChE的氨基酸序列进行比对,发现预测的赤拟谷盗AChE具有该家族所有的保守性功能位点:(1)保守的催化三联体S256,E385,H498(2)六个保守的半胱氨酸残基形成三对二硫键(C106-133,C310-325,C460-576);(3)保守的氧阴离子洞G169,G170,A257;(4)FGESAG序列。另外与电鳐AChE比较发现,赤拟谷盗AChE活性位点谷内排列的9个芳香族氨基酸残基是保守的(W123,W165,Y181,W289,W348,F389,F389,Y392,W490)。 从GenBank数据库中收集了来自37个物种的51个AChE氨基酸序列,结合赤拟谷盗的AChE氨基酸序列,利用DNAMAN软件构建了AChE的分子进化树。结果表明用于分析的所有的AChE基本可以分为4个大的类群:昆虫AChE1类群、脊椎动物AChE类群、昆虫AChE2类群利线虫AChE类群。赤拟谷盗AChE基因为黑腹果蝇AChE基因的直向同源基因(orthologous gene),即Ⅱ型AChE基因。


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