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甘蓝型油菜DH系群体构建技术优化研究

李超  
【摘要】: 十字花科芸薹属作物油菜是世界四大油料作物之一,也是中国主要的油料作物之一。油菜具有适应性强、用途广、经济价值高、发展潜力大等特点。目前,现代生物技术,特别是单倍体培养技术的广泛应用,极大地促进了优质油菜育种、高产育种与抗性育种的进一步结合,不断创新了一批又一批种质资源,也不断选育出优质高产杂交油菜品种。本研究是在前人研究的基础上,对大田自然环境下甘蓝型油菜的小孢子培养体系进行优化研究,建立出适合于大田环境的油菜DH系群体构建技术体系。 1、分批播种试验从8月28日开始到11月16日结束,每10d一批,共九批次。结果发现:第三、四、五和第六期播种的材料才有利于产胚,以第四期播种的材料产胚总量最大,即在9月27日到10月7日之间播种材料更加有利于小孢子培养,研究的4个基因型材料中,第四期和第五期播种的材料产胚数占总产胚数的71.1%。 2、取样时间研究表明:在蕾苔后期和初花期取花蕾培养有利于小孢子诱导胚状体的产生,盛花期次之,蕾薹前期和终花期培养效果最差。产胚情况因不同基因型材料有所不同。取单核晚期和双核早期的小孢子才能产胚,这时多数花蕾长度3.0~3.5mm,其次2.5~3.0mm的花蕾也有产胚的现象,小于2.5mm和大于4.0mm的花蕾很难产胚。 3、通过4℃低温处理花蕾,12h内都适合于小孢子培养,当处理时间达到48h后,产胚很少或者基本不产胚,但以4℃低温处理4h产胚率最高,其次是4℃低温处理8h。通过4℃低温处理花序,在24h内都适合于小孢子培养。不同基因型材料之间,两种处理的产胚率差异不显著;对于同一基因型材料而言,低温处理花蕾的产胚率不如低温处理花序的产胚率高。 4、选择含有2.0%有效氯的NaClO消毒花蕾15~20min或者0.1%HgCl_2消毒10min都能达到良好的消毒和培养效果。 5、游离小孢子提取分离时,B_5液体培养基中蔗糖的浓度可以调整为2%;在胚状体诱导苗的分化时,1.2%琼脂+0.02%NAA+2.0mg/L 6-BA+3.4mg/L AgNO3+3%蔗糖组合更加有利于胚的分化和苗的形成。 6、子叶形或鱼雷形胚状体在1/2MS固体培养基上培养30d就分化出小植株,畸形胚在含有0.1mg/L的GA_3培养基上生长30d后,部分基因型材料可以分化出少数苗,而不含有GA_3培养基上培养的畸形胚,虽能发育成茎状、芽状或叶状组织,但不能正常分化成苗,有的胚状体逐渐变成褐色,最终死亡。 7、在1/2MS固体培养基中,用含2.0~3.0mg/L多效唑培养幼苗,可以在培养瓶中保存3个月左右,且植株生长健壮,根系发育良好,对于大田移栽没有任何影响。 8、在生根培养基中加入0.5mg/L的IBA,有助于幼苗根系、生长发育,根系粗壮,植株生长健壮。但是,高浓度的IBA对植株发育有一定的抑制作用。 9、当生根培养25d后,室内炼苗10~15d,待苗完全成活后,阴天移栽到大田环境中,土壤的消毒和大田环境的良好管理有助于提高幼苗成活率。 10、通过小孢子诱导培养、胚状体分化及幼苗的生根培养,ZB05共培养出240个单株,经过炼苗移栽,最后获得191个单株,田间育性调查,共获得112个正常可育植株。 11、用20对引物对隐性核不育系NAB-2及它的双单倍体植株进行了纯度鉴定,筛选出18对引物具有多态性,共扩增出32个多态性位点,其中有6对引物能将胚状体苗和不育系姊妹交后代明显区分开来。20对引物中有11对引物都检测出了胚状体苗中的一株可育株。从胚状体苗的纯合性观察,有6个单株在DNA水平上存在一定的多态性差异,其他单株之间纯合性一致。在24个姊妹交后代植株中,没有检测出多态性差异。上述研究表明,胚状体苗更能反映出供体群体的遗传纯合状况。


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