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家蚕短散在重复元件BmSer_SINE的鉴定和功能研究

黄科  
【摘要】:家蚕作为一种能吐丝结茧的重要的经济昆虫,是由野桑蚕驯化而来的。丝腺是家蚕泌丝器官,家蚕发育到五龄以后开始大量合成丝蛋白形成茧壳,总计合成大约0.5g。家蚕转基因技术建立以后,如何利用丝腺作为生物反应器高效的合成外源蛋白成为研究者研究的焦点。蚕丝主要成分是丝素和丝胶,利用转基因技术与轻链丝素融合表达的外源蛋白需要高盐高变性剂才能纯化,其原因是丝素蛋白不溶于水。但同为茧丝蛋白的丝胶却是溶于水的,丝胶蛋白在清水中溶解特性表明丝胶1蛋白最先溶解出来,也是含量最多的蛋白。本研究初衷在于克隆家蚕丝胶1基因启动子,利用转基因技术在中部丝腺特异表达可以分泌到茧壳中的外源蛋白。在克隆丝胶1基因启动子时,利用大造品系基因组克隆丝胶1基因启动子,得到的产物大小与GenBank数据库中登录序列一致,而利用N4品种基因组克隆得到的产物大小要比GenBank数据库中登录序列小449个碱基。调查发现在许多家蚕品种丝胶1基因启动子中存在序列的插入(缺失)现象,将449bp插入序列与家蚕全基因组序列和GenBank数据库中序列做BLASTN比对分析表明,它可能是短散在重复元件(short interspersedrepetitive sequence,SINE)。对这一短散在元件的起源、插入位点、功能、功能的作用机理等方面进行了研究。主要研究结果如下: 1.家蚕丝胶1基因启动子多态性研究 根据日本学者Matsunami在GenBank中提交的丝胶1基因上游调控序列(AB007831.1)设计引物扩增家蚕丝胶1基因启动子,选取家蚕、野桑蚕共78个品系对丝胶1基因启动子作了调查。扩增结果表明丝胶1启动子片段大小之间存在差异:7个品种的基因组DNA扩增出与预期大小一致的条带(1kb);46个品种扩增结果比预期条带小,为660bp;9个品种同时扩增出1kb和660bp大小的两条带。利用CLUSTAL.X 1.83对克隆的各个品种的丝胶1基因启动子序列分析表明:①不同品种丝胶1基因启动子660bp的片段序列相似性都较高,存在两处由GCTA和Poly(A)引起的插入突变;(2)克隆不同品种的丝胶1基因启动子1kb片段序列的相似性也很高,也同样存在一处Poly(A)的插入突变;(3)将1kb和660bp序列两者之间比对后表明,前者的丝胶1基因启动子中插入了449bp的碱基序列;④两种类型丝胶1基因启动子序列的共同的特点是都存在SA、SB和SC的顺式作用元件;⑤扩增出的丝胶1基因启动子长度与家蚕品种的生态类型、地理系统来源和化性之间未发现相关性和某种规律性,在家蚕和野桑蚕之间也未见规律性。 2.BmSer_SINE的鉴定 利用家蚕全基因组数据对丝胶1基因启动子中449bp的插入序列分析表明,它在家蚕基因组中的拷贝数为4770个,且均匀的分布在家蚕染色体上,它在家蚕基因组中整合位点为富含TA区域,与家蚕反转座子数据库比对结果表明它可能起源于B1LINE。根据它在基因组中的分布、插入位点、起源,推测它可能是短散在重复序列(SINE),并命名为BmSer SINE。利用PCR和southern杂交技术确认它存在于所有品种的家蚕基因组中。 3.基于细胞水平的BmSer_SINE活性研究 将缺失或者删除的丝胶1基因启动子片段和BmSer_SINE片段克隆到pGL3_basic载体,重组的质粒转染草地贪夜蛾卵巢细胞(Sf9)和家蚕胚胎细胞(BmE),利用双荧光素酶报告系统间接检测缺失或者删除的丝胶1基因启动子和BmSer_SINE序列活性。结果表明BmSer_SINE作为启动子的萤火虫荧光素酶在(Sf9)和(BmE)中都有相对活性,而缺失或者删除的丝胶1基因启动子片段,仅在含完整BmSer_SINE序列时,在BmE中有微弱的启动活性,而无论何种序列在Sf9细胞中均无启动子活性。结果表明,完整的BmSer_SINE序列可能具有启动子活性。 4.Bmser_SINE对丝胶1基因启动子活性和表达模式的影响研究 将缺失或者删除的丝胶1基因启动子和红色荧光(DsRed)、腺病毒SV40的终止序列构建成表达盒,再将表达盒克隆到pBac[3XP3-EGFP]载体形成pBac[3XP3-EGFP,Ser-DsRed]重组质粒。利用转基因技术分别将各种丝胶1基因启动子序列片段驱动的DsRed表达盒整合到家蚕基因组中形成家蚕转基因系。利用定量PCR检测DsRed的转录水平,检测缺失或者删除的丝胶1基因启动子活性,结果表明,丝胶1基因启动子中的BmSer_SINE序列具有增强子的活性,利用Western blot检测丝胶中DsRed的表达量,结果表明BmSer_SINE具有增强蛋白质翻泽的功能。此外,将转基因系的整个丝腺、脂肪体在荧光显微镜下检测,DsRed仅在中部丝腺表达。结果表明:①BmSer SINE对丝胶1基因启动子的组织特异性表达没有调控作用;②决定丝胶1蛋白组织特异性表达的调控元件在丝胶1基因启动子的-148~-1区域。 5.BmSer_SINE增强子的机理初探 经http://www.cbil.upenn.edu/cgi-bin/tess/tess?RQ=WELCOME预测BmSer_SINE序列中含有转录因子的结合位点,凝胶迁移实验验证BmSer_SINE中存在的顺式元件能与转录因子结合,Cy3标记的片段与转录因子形成的复合物经LC/MS/MS鉴定为真核生物翻译起始因子、延伸因子、ATPase、GTP结合蛋白及核糖核蛋白等核因子。 将BmSer_SINE与GenBank数据库和家蚕EST数据库、CDS数据库、芯片数据库分析表明:BmSer_SINE插入到19个已经鉴定基因的内含子中;插入到46个未鉴定基因的编码序列中。芯片数据分析表明:前者都有表达信号值,后者有23个基因有表达信号值。以血清蛋白基因的信号值(18.9)作标准,分析表明42个有信号值的基因中有16个基因的信号值高于或接近于18.9。根据这一结果推测BmSer_SINE具有作为增强子的广谱性。


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1 黄科;家蚕短散在重复元件BmSer_SINE的鉴定和功能研究[D];西南大学;2009年
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