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球孢白僵菌T-DNA插入突变体Mu301的鉴定及分析

王芯  
【摘要】: 球孢白僵菌{Beauveria bassiana)是一种重要的昆虫病原真菌,具有主动侵染寄主、循环侵染以及寄主不易产生抗性等优点,在农林害虫的防治中占据重要地位。但存在致病潜伏期过长及防效不稳定等缺陷,使其推广使用受到制约。目前,球孢白僵菌发育分化和侵染致病的分子机理等研究相对较少,在分子水平上阐明其侵染致病过程中相关基因的结构功能,对充分挖掘其防治潜力,促进真菌杀虫剂广泛运用有重要意义。 在球孢白僵菌的功能基因的研究中,分子标签技术是一种有效的工具。本论文构建了球孢白僵菌T-DNA随机插入突变体库,并从中筛选出一株菌落生长缓慢,毒力降低的突变体Mu301,利用Sitefinding-PCR法克隆了T-DNA标签基因,发现该基因与3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶β亚基有较高的同源性。 论文的主要研究结果如下: 1.筛选获得突变体 构建了球孢白僵菌T-DNA随机插入突变体库,从中筛选到菌落生长缓慢,致病时间显著推迟的突变体Mu301。3次连续传代分析表明,该突变性状能稳定遗传。 2.3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶β亚基的基因克隆与特征分析 经过连续3次Sitefinding-PCR方法克隆突变体Mu301的T-DNA插入位点左翼2760bp的核苷酸序列,比对发现该片段与Aspergillus nidulans中3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶β亚基的编码基因MCCB有83%同源性。序列分析发现,T-DNA元件插入在MCCB基因的起始密码子ATG上游-485的位置,推测此种插入方式,破坏了MCCB的启动子区域。此段序列覆盖了MCCB的全长编码框,其中有一个76bp的内含子,此MCCB终止密码子为TAA。 3. MCCB基因的同源敲除 为了进一步确定MCCB的功能,分离了T-DNA标签基因,构建了MCCB同源重组载体pPZPtk8.10-MCCB51-bar-MCCB31.应用农杆菌介导转化球孢白僵菌,获得了MCCB基因的同源敲除突变菌株△mccB 111,△mccB 205和△mccB 277,为进一步研究球孢白僵菌的生长发育提供了材料。 4.MCCB敲除突变体表型观察 以亮氨酸(Leucine)作为球孢白僵菌生长的唯一氮源和碳源,观察发现:△mccB 111,△mccB 205和△mccB 277在添加30mM Leucine的基本培养基上生长受到明显的抑制,这表明敲除MCCB影响了菌体对Leucine的利用。


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