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部分野生百合(Lilium.)的核型和ISSR分析

刘华敏  
【摘要】: 本文采取了两种方法对采集到的野生百合进行亲缘关系分析。第一部分中对采集到的14种野生百合核型进行分析,并用聚类方法分析其亲缘关系。第二部分中,除了早期收集到的14种百合之外,又增加了6种未鉴定的野生种,进行ISSR分析。主要结论如下: 1、核型共性 本研究中的百合种均是大型染色体,染色体基数x=12,绝大多数为二倍体(2n=2x=24),仅卷丹为三倍体(2n=3x=36)。川百合、卷丹、山丹的核型为3A型以外,其余均为3B型。这三种核型的不对称程度均较高,说明百合属植物的核型均较为进化,它们在植物系统演化上可能处于衍生或较进化的地位;染色体组成大都包括2对具中部或近中部着丝点的长染色体和10对具近端部或端部着丝粒的短染色体,且在第1对染色体上常可见到居间随体。 2、核型多样性 所研究的14种野生百合核型具有较丰富的多样性。主要表现为染色体的组成差异、随体的数目及其在染色体上的分布、B染色体的有无及其类型变化。 根据染色体的组成类型差异,可将14个百合种大致分为3大类,即: (1)具有m、sm、st、t染色体的百合,包括卷丹、南川百合、野百合、宜昌百合、山丹、岷江百合、麝香百合、兰州百合、大理百合、湖北百合。 (2)具有m、sm、t染色体的青岛百合。 (3)具有m、st、t染色体的百合,如泸定百合、川百合、淡黄花百合。 所研究的野生百合除了泸定百合、青岛百合、麝香百合不具有位于第1对染色体上的居间随体之外,其他的都有;少部分百合具有位于第11对染色体长臂上的随体,如宜昌百合、青岛百合、兰州百合具有位于第7对长臂上的随体;具有第1、6、8对上的居间随体的山丹;具有2对位于长臂上的随体的青岛百合。 所研究的野生百合,在湖北百合中发现有三种数目B染色体,分别为1、2、6条端部B染色体,宜昌百合有一条近中部B染色体。 3、核型进化 根据Levitzky-Stebbins对有花植物核型进化中的对称-原始,不对称-进化的观点,将14种百合按核型不对称系数由高到底排为:淡黄花百合卷丹麝香百合泸定百合大理百合岷江百合野百合南川百合湖北百合川百合山丹宜昌百合青岛百合兰州百合。即进化程度由高到低淡黄花百合卷丹麝香百合泸定百合大理百合岷江百合野百合南川百合湖北百合川百合山丹宜昌百合青岛百合兰州百合。 4、聚类分析与种间亲缘关系 根据聚类结果将14种百合分为3大类:第一类:卷丹;第二类:湖北百合;第三类:青岛百合、山丹;第四类:兰州百合、岷江百合、大理百合、蛋黄花百合、麝香百合、野百合、泸定百合、宜昌百合、川百合、南川百合。 5、本研究中发现用改良CTAB法,0.2g新鲜叶片,提取液中加入2%的PVP和2%的B-巯基乙醇能得到浓度、纯度较高的DNA,适于百合ISSR分析。 6、经过对PCR体系中的DNA、引物、Mg~(2+)、Taq 4因素进行3水平的正交试验,挑出条带最多最清晰的组合,再在它的基础上进行单因素的调整,最后得出最佳的PCR反应体系为:10×PCR buffer缓冲液2.5ul、2.5mm/l dNTP 2.0ul、25mM/L的镁离子1.5u1、5unh/L的引物1.0ul,模板DNA 10-20ng(0.3ul)、taq酶0.3ul(1.5U)、17.4u1的双蒸水。 经过反复试验,反应程序优化为:94℃5min,94℃45s,适宜退火温度45s,72℃75s,40个循环,72℃8min,25℃。 7、通过挑选出的6条引物,扩增出180条多态性带,进行聚类分析,发现分析的20个样百合可以分为以下5大类:第一类:泸定百合、未鉴定百合、宜昌百合、未鉴定4、川百合、岷江百合、兰州百合;第二类:卷丹、未鉴定3;第三类:青岛百合、淡黄花百合、麝香百合、野百合、大理百合、未鉴定2、湖北百合;第四类:山丹;第五类:毛百合、未鉴定1。 8、核型聚类将14种百合聚为4大类,ISSR聚类将20种百合聚为5大类。两种分析方法得到的聚类结果非常相似,形态分类中百合组的大部分百合聚为一组,而卷瓣组相对分散。核型聚类中无钟花组百合,而在ISSR聚类中,钟花组的毛百合单独聚为一类。核型聚类中轮叶组的青岛百合较早被分离出来,而在ISSR聚类中,却与百合组归为一类。两种聚类方式的结果存在差异的原因可能是植物在染色体的形态上发生了变异,但是基因水平上并未发生变异,或者是基因水平发生了变异,染色体形态却未发生变异。在具体分类中,可以考虑将形态学分类、核型分析、ISSR分析结合使用。


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