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转基因干涉ie-2和lef-3基因对BmNPV体外增殖的影响

成传刚  
【摘要】: 家蚕核型多角体病毒是蚕业生产上最常见且危害最严重的一类病原微生物,对其研究具有重要的科学意义和产业应用价值。本实验选择了家蚕核型多角体病毒的早期表达基因ie2及晚期表达因子lef3这两个与病毒复制、增殖密切相关的基因作为抑制靶标,通过构建能稳定转录形成靶标基因dsRNA的转基因干涉载体(pigA3EGFP-39KPie2, pigA3EGFP-39KPlef3, pigA3EGFP-IElPlef3)转染家蚕胚胎细胞系(BmE)。通过G418的压力选择,获得能稳定产生dsRNA的三种转基因细胞系。线性化修饰过的病毒Bm-BacPAK6和野生型BmNPV的攻毒试验表明:转基因细胞能产生目标基因dsRNA,对病毒在细胞中的复制、增殖均有一定的抑制作用。 本实验具体研究内容如下: (1)、靶基因片段的克隆 克隆了家蚕核型多角体病毒(BmNPV)复制和增殖过程中的比较重要的两个基因——极早期表达基因ie-2和晚期表达因子lef-3的部分区域:ie-2基因的+623~+1186区域(共564bp)和lef-3基因的+233~+926区域(共694bp)的片段。 (2)、转基因干涉载体的构建 利用包含两个不同启动子——极早期表达基因ie-1的启动子和迟早期基因39k的启动子的载体骨架,将目的基因片段以反向串联方式连接,构建转基因干扰载体pigA3-EGFP-39KPie2、pigA3-EGFP-39KPlef3和pigA3-EGFP-IE1Plef3。这些载体上都含有EGFP作为报告基因,以neo作为抗性筛选标记。 (3)、筛选并获得转基因干涉细胞系 对实验室保存的对BmNPV敏感的家蚕胚胎细胞系(BmE)进行转染,并通过抗生素G418压力筛选获得了稳定表达干涉靶基因相应dsRNA的转基因细胞。 (4)、转基因干涉载体对病毒体外增殖的影响 分别接种线性化修饰过的家蚕核型多角体病毒Bm-BacPAK6和野生型BmNPV,研究稳定转化细胞的抗病能力。研究结果表明:转基因细胞能产生目标基因dsRNA,对病毒在细胞中的复制、增殖均有一定的抑制作用,对病毒的抑制效果依次为:pigA3-EGFP-39KPie2 pigA3-EGFP-IE1Plef3 pigA3-EGFP-39KPlef3.


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