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嗜卷书虱P450基因的分子生物学特性及其异源表达研究

蒋红波  
【摘要】: 书虱(psocids)属于虱啮目Psopotera、书虱科Liposcelididae、书虱属Liposcelis,是一类重要的储藏物害虫,大量发生时可造成严重的经济损失,且对化学药剂的抗性发展很快,已经引起了全世界储藏物工作者的高度重视。然而与其它农业害虫相比,以往对该类害虫包括其它储藏物害虫的研究主要集中在应用研究层面,较少涉及基础或应用基础研究领域。昆虫细胞色素P450是昆虫体内一种重要的代谢酶,在昆虫的生命活动中具有重要的生理功能。其中细胞色素P450对杀虫剂的代谢作用增强是大多数昆虫产生抗药性的主要机制之一,这一机制也常被认为是最为重要的一个抗性机制,而且由于其催化底物的多样性,细胞色素P450极有可能介导昆虫的交互抗性。本学位论文在国家自然科学基金(30871631)、教育部新世纪优秀人才支持计划(NCET-04-0854)以及西南大学研究生创新基金优秀博士生项目(kb2008001)的资助下,以目前世界范围内危害严重的嗜卷书虱Liposcelis bostrychophila Badonnel为对象,瞄准昆虫P450功能研究的这一热点问题,率先开展了嗜卷书虱P450基因分子生物学特性及异源表达方面的研究,旨在认识嗜卷书虱细胞色素P450的生理功能、了解P450与书虱抗性形成与发展的相互关系、鉴定书虱抗性相关P450基因以及揭示其介导书虱抗药性的分子机制。通过近4年的研究,取得了如下研究结果: 1嗜卷书虱Housekeeping基因的克隆及内参基因的筛选 1.1 Housekeeping基因的克隆及序列分析 结合反转录PCR(reverse transcriptase-PCR,RT-PCR)与cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)等技术,首次成功地从嗜卷书虱体内分离克隆获得了4个不同的Housekeeping基因Lbp-Actin1、Lbβ-Actin2、Lba-Tubulin及LbGapdh的cDNA全序列,GenBank登录号分别为FJ196622、FJ447483、FJ595242及FJ595241.通过序列分析,明确了4个Housekeeping基因的开放阅读框,并推导了其编码的氨基酸序列。进一步利用Protparam、Scanprosite、PSORT、TMHMM、SignalP 3.0以及ProtFun等生物信息学软件分析了上述Housekeeping基因编码蛋白质的理化性质、保守基序、细胞内的定位、跨膜结构、信号肽序列以及潜在的生理功能。使用Mega 4.01软件应用Neighbor Joining方法构建了其相应的系统发育树并明确了与其它物种相应Housekeeping基因的遗传距离。此外,应用蛋白质三维结构同源模拟工具SWISS-MODEL,成功地构建了各自的三维结构模型。研究结果丰富了嗜卷书虱的遗传信息,并且为将来深入探讨啮目昆虫的进化关系提供了可能的分子标记。1.2内参基因的筛选 研究表明,在实时定量PCR(qPCR)中选用不同的内参基因可能会对基因表达转录分析的结果产生重要影响。然而在昆虫学的相关研究中,内参基因筛选这个重要的问题却常被忽视。本研究在成功建立嗜卷书虱5个候选内参基因(Lbβ-Actin1、Lbβ-Actin2、Lba-Tubulin、LbGapdh及18S rRNA)qPCR反应体系的基础上,利用NormFinder和geNorm分析软件综合评估了这5个候选内参基因在嗜卷书虱不同发育阶段、不同品系以及溴氰菊酯诱导条件下mRNA表达的稳定性,筛选出了适用于不同试验条件的嗜卷书虱基因表达转录分析的内参基因Lbp-Actin1。进一步利用绝对定量方法分析了嗜卷书虱经药剂诱导其体内Lbβ-Actin1 mRNA表达量的时间动态(8、12、24、36及48 h),验证了其作为嗜卷书虱基因表达转录分析中内参基因的稳定性。同时以最稳定的Lbβ-Actinl及最不稳定的18S rRNA分别作为内参对嗜卷书虱CYP6CE2在不同发育阶段、药剂诱导前后的相对表达量进行比较分析,结果发现无论是在不同的发育阶段,还是在药剂诱导的情况下以18S rRNA作为内参时CYP6CE2的表达模式均与以Lbp-Actin1作为内参基因时的表达模式差异极大,进一步证实了前人关于核糖体基因不适宜用作内参基因的推测,充分证明了基因表达转录分析中内参基因的选用对定量分析的结果具有重要的影响。 2嗜卷书虱P450基因的克隆及其表达模式解析 2.1 P450基因的克隆及序列分析 结合RT-PCR与RACE等技术,首次成功地从嗜卷书虱体内分离克隆了5个全新的P450基因CYP6CE、CYP6CE2、CYP4CB1、CYP4CC1及CYP4CD1的cDNA全序列,GenBank登录号分别为EF421245、EF421246、EU979550、EU979549和EU979551。通过序列分析明确了上述5个P450基因的开放阅读框,并推导了其编码的氨基酸序列。进一步利用Protparam、Scanprosite、PSORT、TMHMM、SignalP3.0以及ProtFun等生物信息学软件分析了推导蛋白质的理化性质、保守基序、细胞内的定位、跨膜结构、信号肽序列以及潜在的生理功能。序列分析结果表明克隆获得的5个细胞色素P450基因均为细胞微粒体型P450,极有可能在嗜卷书虱体内参与外源化合物的代谢。在GenBank中选取了近40条已发布且功能己知的P450基因(主要为第四家族和第六家族成员)编码的氨基酸序列,使用Mega 4.01软件应用Neighbor Joining方法构建了系统发育树并明确了与其它物种P450基因的遗传距离。结果表明CYP6CE1、CYP6CE2与多个抗性相关的CYP6家族成员具有较高的同源性,据此推测CYP6CE1、CYP6CE2可能参与嗜卷书虱抗药性的形成。此外,应用蛋白质三维结构同源模拟工具SWISS-MODEL成功地构建了CYP6CE1及CYP6CE2的三维结构模型。然而,由于在蛋白质晶体结构数据库中还未有与CYP4CB1、CYP4CC1及CYP4CD1同源性达到20%以上的蛋白,因此无法对嗜卷书虱这3个细胞色素P450蛋白的三维结构进行模拟。 2.2 P450在不同发育阶段的表达模式 利用嗜卷书虱在27.5℃的条件下完成各个不同发育阶段所需要不同时间的这一生物学特性,通过时间上的控制,获得了处于不同发育阶段(卵、一龄、二龄、三龄、四龄若虫以及成虫)的书虱用于总RNA的提取。进而通过制作标准曲线、计算引物的扩增效率以及分析扩增产物的熔解曲线,成功建立了嗜卷书虱CYP6CE1、CYP6CE2、CYP4CB1、CYP4CC1和CYP4CD1等5个P450基因的qPCR反应体系。以Lbp-Actin1基因作为内参,对5个P450基因在嗜卷书虱不同发育阶段的mRNA表达水平进行了相对定量分析。结果表明,嗜卷书虱3个CYP4家族的P450基因均在成虫期表达量最高。其中,CYP4CB1在嗜卷书虱二龄若虫体内的相对表达量显著低于其它龄期,在成虫期表达量最高,其余4个龄期内的表达均无显著差异。CYP4CC1的相对表达量在成虫体内最高,在卵和二龄若虫中较低。其中成虫期表达量约为卵期的7倍,二龄若虫期表达量约为卵期的0.5倍,而其余3个龄期的相对表达量波动幅度不大均在2左右。CYP4CD1在卵期的表达量最低,成虫期的表达量约为卵期的7倍,其余各龄期间的相对表达量近乎恒定,维持在卵期表达量的2倍左右,且无显著差异。 2.3 P450在药剂诱导后的表达模式 在生物测定明确了嗜卷书虱对溴氰菊酯、甲基对氧磷和涕灭威毒力的基础上,建立了两种不同的诱导体系:即低剂量(LC10)长时间持续诱导和较高剂量(LC50)短时间诱导体系。利用qPCR技术,以Lbβ-Actin1为内参基因,分析了嗜卷书虱5个P450基因在低剂量(LC10)溴氰菊酯诱导前后其mRNA表达量的变化,明确了嗜卷书虱5个P450基因分别对低剂量溴氰菊酯的诱导反应。结果表明,低剂量(LC10)溴氰菊酯诱导可显著提高嗜卷书虱体内CYP6CE1、CYP6CE2、CYP4CB1、CYP4CC1基因的相对表达量。其中,CYP6CE1表达量上升最高大约为对照组的2.8倍;CYP6CE2、CYP4CB1、CYP4CC1相对表达量上升了2倍左右;然而,CYP4CD1的相对表达量经低剂量溴氰菊酯诱导后却显著地下降。 此外,利用较高剂量(LC50)的溴氰菊酯、甲基对氧磷、涕灭威处理嗜卷书虱30 min后,采用qPCR技术分析了上述P450基因经药剂诱导后其mRNA表达的时间动态(8、12、24、36及48 h)。qPCR结果表明CYP6CE1、CYP6CE2、CYP4CB1及CYP4CC1可被溴氰菊酯、甲基对氧磷显著的诱导。其中,溴氰菊酯诱导后36 h CYP6CE1、CYP6CE2、CYP4CB1及CYP4CC1的相对表达量达到最高分别为对照的2.l、1.5、3.0以及1.8倍;甲基对氧磷诱导后24 h这4个P450基因的相对表达量达到最高峰分别为对照的3.9、1.5、6.6及2.6倍。涕灭威对嗜卷书虱4个可被溴氰菊酯、甲基对氧磷诱导的P450基因均无显著的诱导作用,而CYP4CD1的表达量在涕灭威的诱导后36 h达到高峰为对照的4.7倍。由此可见,CYP4CD1可能与其它4个P450基因具有不同的生理功能:CYP6CE1、CYP6CE2、CYP4CB1及CYP4CC1极有可能参与了溴氰菊酯、甲基对氧磷在嗜卷书虱体内的代谢过程,而CYP4CD1可能参与了涕灭威在嗜卷书虱体内的代谢过程。 2.4 P450在不同品系中的表达模式 利用qPCR技术,以Lbp-Actin1为内参基因,分析了嗜卷书虱5个P450基因在实验室选育并保存的嗜卷书虱DDVP、PH3抗性品系及敏感品系中的表达模式。结果表明,除CYP4CC1外其它4个P450基因在2个抗性品系中均有不同程度的过量表达,但上调表达的幅度不高(均未超过2倍),这一现象暗示这4个P450基因极有可能共同参与嗜卷书虱抗性的形成。由此可见,书虱抗性形成并非由单一的基因或酶类介导,而是其体内多种酶类协同作用的结果。 3嗜卷书虱P450基因的原核表达 基因异源表达技术是基因工程技术的核心,是功能基因组学研究中明确基因功能的一个基础研究。本研究采用Gateway(?)支术成功构建了嗜卷书虱CYP6CE1和Lbβ-Actin1基于pDestl7的原核表达载体,经Western Blot检测证实大肠杆菌中表达的重组蛋白就是CYP6CE1-pDestl7和Lbβ-Actinl-pDestl 7的重组蛋白,从而实现了这2个基因在大肠杆菌体内的异源表达。同时利用BamHI和Xhol的双酶切以及DNA重组技术构建了嗜卷书虱CYP6CE1、CYP4CB1、CYP4CC1及CYP4CD1基于pET4317.1a(+)的原核表达载体。为了提高P450基因异源表达产物的产量和产物的分离纯化等,通过对PCR上游引物5,的改造实现了对细胞色素P450蛋白的N端修饰。包括去除信号肽序列,将起始密码子ATG之后的第二个密码子替换为GCT,在该密码子之后引入4个连续的CAT编码组氨酸的标签等。最后,利用BamHI和XbaI的双酶切以及DNA重组技术,成功构建了嗜卷书虱CYP6CE1、CYP4CB1、CYP4CC1及CYP4CD1基于pCW的原核表达载体。异源表达的实现为将来深入研究表达产物的生化及毒理学特性奠定了坚实的基础。 4嗜卷书虱CYP6CE1等位基因多态性 P450等位基因的点突变对其蛋白结构、底物识别、催化活性及功能具有重要影响。本研究采用RT-PCR技术从嗜卷书虱敏感品系和2个抗性品系体内分离克隆了3个CYP6CE1的等位基因CYP6CE1v1、CYP6CE1v2和CYP6CE1v3(GenBank登录号分别为EF421245、EU266572及EU266573)。序列比对发现CYP6CE1v2与CYP6CE1v3核苷酸序列中有15个多态性位点及其所在的位置。序列分析明确了CYP6CE1v2的15处多态性位点仅导致了其编码的蛋白质1处氨基酸替换,而CYP6CE1v3编码的蛋白质却发生了5处氨基酸替换。利用Protparam软件对CYP6CE1v1-3所编码蛋白质的基本参数进行预测,发现CYP6CE1v2与CYP6CE1v1编码的蛋白质在性质上差异不大,但与CYP6CE1v3编码的蛋白质在性质上存在明显差异。进一步使用蛋白质三维结构同源模拟工具SWISS-MODEL对上述3个等位基因编码蛋白质的三维结构进行模拟,在理论上证实了CYP6CE1v3编码蛋白的3处氨基酸替换均对其三维结构产生一定的影响。 综上所述,本研究克隆获得了嗜卷书虱体内的4个持家基因cDNA全序列,丰富了嗜卷书虱的遗传信息,并且为将来深入探讨啮目昆虫的进化关系提供了可能的分子标记;分离获得了5个细胞色素P450新基因的cDNA全序列,为深入研究嗜卷书虱P450酶系统的功能奠定了坚实的基础;利用分子生物学最新研究成果筛选出了基因表达转录分析中稳定表达的内参基因,搭建了书虱基因表达转录分析的研究平台;并在此基础上,利用实时定量PCR技术全面解析了这5个细胞色素P450基因在嗜卷书虱不同发育阶段、不同品系以及药剂诱导后的表达模式;此外,还进行了细胞色素P450的原核表达和重组蛋白离体研究。研究成果将促进对嗜卷书虱细胞色素P450基因生理功能的认识,为嗜卷书虱抗性相关P450基因的鉴定提供理论依据,并对阐释细胞色素P450介导嗜卷书虱代谢抗性的分子生物学机制具有重要的理论意义。


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