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三种杨树再生体系的建立及三倍体银中杨转YUCCA1基因的研究

刘曦珏  
【摘要】: 杨树是杨柳科(Salicaceae)杨属(Populus)植物的统称,具有早期速生、适应性强、分布广、种类和品种多、容易杂交、容易改良遗传性、容易无性繁殖等特点,广泛用于生态防护林、三北防护林、农林防护林和工业用材林,同时也是道路绿化、园林景观的优秀树种。而且,杨树作为速生树种之一,世界范围内栽培广泛,遗传资源丰富,无性再生能力强,生长迅速,轮伐周期相对较短,被普遍认为是未来生物能源的重要物种之一。但是依靠常规育种方法,育种周期长,工序复杂,且受气候、地域和水分等的影响,选育新品种难度大,难以满足有目的定向培育杨树新品种的需要。自80年代以后,现代分子生物学技术,尤其是基因工程技术的发展给杨树育种带来了前所未有的变革,极大地提高了育种效率和扩展了育种目标。至今为止,杨树转基因育种工作已开展二十多年,虽然转基因技术已日渐成熟,但仍存在缺乏转化受体系统及转化率低等问题。因此,建立高效稳定的杨树离体再生体系和遗传转化体系,可为进一步进行转基因育种和基因功能快速验证提供技术平台,具有重要的科学意义。 本研究以三倍体银中杨(Triploid Populus alba×P.berolinensis)、中林46杨(P.deltoides Cl. 'Zhonglin46')、西丰杨25号(P.deltoldes Bartr.×P.cathayana Rehd.Cl.'Xifeng-25')三个杨树品种为试验材料,通过对不同培养阶段最佳培养基的筛选,建立了其稳定高效的再生体系,并在此基础上,以三倍体银中杨试管苗叶片为受体材料,利用根癌农杆菌介导法转化YUCCA1基因,对影响三倍体银中杨转化效率的主要因素进行了研究,研究结果如下: 1、三种杨树高效再生体系的建立:以三倍体银中杨、中林46杨和西丰杨25号带芽茎段为外植体,通过一系列试验,建立了三种杨树的高效再生系统,筛选出三种杨树不同阶段最佳培养基与激素浓度分别为: (1)三倍体银中杨:①初代培养:1/2MS+TDZ0.02 mg.L-1(单位下同)+NAA0.05,10 d后腋芽萌发,30 d后腋芽萌发率可达96%,芽平均长度为6.0 cm;②继代培养:MS+BA0.05+NAA0.02,30 d后分化率可达100%,茎高为3.5 cm,60 d茎高达7.0 cm:③生根培养:1/2MS+NAA0.05+1BA0.20,20 d后生根率可达100%。 (2)中林46杨:①初代培养:1/2MS+BA7.5+NAA0.05+TDZ0.02,10 d后腋芽萌发,30 d后腋芽的萌发率为88%,芽平均长度为4.0 cm;②继代增殖培养:MS+BA0.5+NAA0.05+IBA0.1,30 d后分化率可达92%,平均不定芽数10.2个;③壮苗培养:MS+BA0.1+IBA0.3,30 d后茎高3.5 cm,壮苗率为90%;④生根培养:1/2MS+NAA0.01+IBA0.3,20 d后生根率可达93%; (3)西丰杨25号:①初代培养:1/2MS+TDZ0.02+NAA0.05,10 d后腋芽萌发,30 d后腋芽的萌发率为94%,芽平均长度为5.0 cm;②继代增殖培养:MS+TDZ0.02+NAA0.05,30 d后分化率可达96%,平均不定芽数12.1个;③壮苗培养:MS+BA0.02+NAA0.02,30 d后茎高5.0 cm,壮苗率为92%;④生根培养:1/2MS+NAA0.02+IBA 0.3,20 d后生根率为90%。 上述培养基均添加25 g.L-1蔗糖、7 g.L-1琼脂,pH值为5.8,培养温度(25±2)℃,光照度2000 lx,光照时间12-14 h.d-1。 2、三倍体银中杨遗传转化受体系统的建立:以三倍体银中杨试管苗叶片为外植体,建立了叶片不定芽再生体系,并在此基础上,确定了不定芽再生和生根的卡那霉素(Km)选择压及抑菌抗生素浓度。结果表明,三倍体银中杨最佳叶片不定芽再生培养基为1/2MS+BA0.6+NAA0.1+25 g.L-1蔗糖+7 g.L-1琼脂,不定芽再生率达99.4%,每叶平均生芽数约10.1个;叶片不定芽再生和生根的Km选择压均为50 mg.L-1;mg·L-1,且不会影响叶片不定芽的再生及生根。 3、三倍体银中杨遗传转化条件的优化:以银中杨试管苗叶片为受体材料,研究了预培养时间、侵染菌液浓度、侵染时间、共培养时间、共培养基中添加乙酰丁香酮浓度、选择方式6个因素对三倍体银中杨遗传转化效率的影响。结果显示三倍体银中杨最优转化条件为:叶片预培养2 d,OD_(600nm)=0.6的菌液侵染20 min,共培养4 d,共培养基中添加乙酰丁香酮50μmol.L-1,共培养后延迟14 d选择。经过不定芽再生选择培养和不定芽生根选择培养,共获得62株Km抗性植株。 4、Km抗性植株的PCR检测:将获得的62株Km抗性植株进行PCR检测,结果显示有16株呈阳性反应,初步证明YUCCA1基因已被导入到三倍体银中杨基因组中。 综上所述,本研究以三倍体银中杨、中林46杨和西丰杨25号为试验材料,在建立其稳定高效再生体系的基础上,采用根癌农杆菌介导法对三倍体银中杨进行了YUCCA1基因的遗传转化研究,建立了具有一定转化率的三倍体银中杨遗传转化体系,为进一步进行杨树转基因育种工作提供了科学依据。


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