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家蚕体色突变黑蛾(Bm)的分子定位及候选基因的筛选研究

李雪  
【摘要】: 家蚕作为鳞翅目昆虫的代表,是至今唯一被人类完全驯化的经济类昆虫,也是遗传学研究的极好的材料。并且家蚕遗传图谱也经历了近百年的研究,将大约300多个突变性状定位在了230多个位点上。随着DNA分子标记技术的逐渐发展以及该技术在家蚕研究中的应用,找到与突变基因连锁的分子标记,便可将这些基因在染色体上进行定位并进一步克隆相关性状的基因。家蚕高精密遗传图谱和物理图谱的相继构建成功,EST数据库以及基因芯片和表达图谱的制作成功,尤其是全基因组精细图谱的公布,为家蚕基因的精细定位以及后续的定位克隆创造了条件。正是由于这些进展,近年来家蚕的一些突变体基因才得以鉴定克隆。因此,定位克隆工作成为家蚕遗传学的重要课题和工作热点。 西南大学蚕学与系统生物学研究所的蚕基因库目前保存有600多种重要的突变体,在这些突变体中有许多是与生产、遗传育种等重要性状相关的。黑蛾(Black moth, Bm)是家蚕成虫体色突变的一种。其表现性状为:成虫翅和胴体黑褐色,但幼虫体色与正常家蚕幼虫无区别。该突变位于经典连锁图谱中第17连锁群0.0cM处。本研究是通过利用蝴蝶中控制颜色模式多样性的超基因位点与家蚕进行同线性分析,利用同线性分析结果对该突变进行分子标记的筛选并利用BC1群体的连锁分析进行定位研究及候选基因的预测,研究内容及主要结果如下: (1)分子标记的筛选:利用蝴蝶中调控体表颜色图纹的一段保守的超基因位点序列与家蚕基因组进行同线性分析,得到在家蚕中的同源区域。根据同线性分析的结果设计引物,对定位系统的亲本C108,大造-Bm近等位基因系,及大造-Bm的亲本黑蛾(Black moth)进行多态性的筛选。得到2个可用多态性片段。并对已经完成的家蚕SSR分子标记中第17连锁群的部分SSR引物进行筛选,得到1个可用多态性位点。 (2)分子标记的验证:利用BC1群体中的连锁群体的20个个体基因组对以上3个分子标记进行连锁验证,并对分子标记HD2和M-7进行部分区域的测序。结果显示3个分子标记都与Bm连锁。 (3)突变基因Bm的连锁定位分析:用验证的分子标记对培育的第17连锁群的近等位基因系与C108杂交的BC1定位群体中的417个个体进行分析,得到正常个体与突变个体的带型。其中有1个个体在标记M-7和Bm之间发生了交换,交换率为:0.24%,有6个个体在标记HD2和Bm之间发生了交换,交换率为:1.44%,有9个个体在标记S1702和Bm之间发生了交换,交换率为:2.16%。利用JoinMap 4.0软件将突变基因及3个分子标记整合成连锁图谱。该图总距离为3.8cM,Bm被定位在分子标记M-7与HD2之间距M-7标记0.2cM的位置。 (4)候选基因的筛选:通过对连锁定位分析结果以及由大造及大造-Bm近等位基因系为材料制备的芯片数据进行分析,发现在分子标记M-7与HD2之间有两个差异表达的基因gene3和gene4。 本实验的研究表明,同线性分析可以对基因定位提供有用信息。通过对分子标记的筛选验证以及回交群体的连锁分析我们完成了对目标基因Bm的定位和候选基因的初步筛选,为进一步克Bm基因及其功能分析奠定了基础。


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