家蚕特有基因的鉴定、表达模式分析及功能初探

【摘要】： 昆虫是地球上种类最丰富的动物群体,在生态系统中占据重要地位。昆虫形态多样,种类繁多,其物种与形态的多样性是在长期进化过程中对复杂的生存环境逐渐适应的结果。然而,物种的多样性与生理功能之间存在不可分割的联系,换句话说是遗传物质决定了物种的生物学性状。随着越来越多基因组序列的测定,从基因组水平去研究物种特有基因的功能可能会为物种在分化、行为习性和形态上区别于其它生物提供重要线索。 家蚕是典型的鳞翅目模式昆虫,也是被人类驯化的重要经济昆虫。家蚕及更多物种的全基因组序列的测定为我们研究家蚕特有基因提供了平台。物种特有基因是指与其它物种没有同源性的可编码蛋白的基因序列,亦被称为“孤儿基因”或"ORFans"。对基于家蚕基因组序列的家蚕特有基因乃至鳞翅目特有基因的研究,可以帮助我们了解特有基因在家蚕体内行使的特殊功能,还可以帮助我们了解家蚕在驯化过程中导致适应性变异产生的机理,为未知功能基因的研究提供基础信息。本研究获得的主要结果如下： 1.家蚕特有基因的鉴定及序列分析 利用家蚕、蜜蜂、果蝇、按蚊、伊蚊、赤拟谷盗、线虫、人和原鸡等几个物种的基因组序列及Butterflybase数据库中鳞翅目昆虫所有报道的基因序列,通过同源序列比对的方法,鉴定了家蚕、蜜蜂、果蝇、按蚊、伊蚊及赤拟谷盗六个昆虫基因组中的特有基因。在家蚕基因组中,特有基因共有2051个,占所有预测基因的14%,我们还鉴定出在家蚕基因组中有340个基因为鳞翅目特有基因。蜜蜂、果蝇、按蚊、伊蚊和赤拟谷盗的基因组中分别有特有基因878、2611、1078、1383和4142个；各占了基因组的7.9%、12%、8.2%、8.2%和24.8%。EST数据分析发现,在家蚕特有基因和鳞翅目特有基因中,分别有911和227个基因具有EST表达证据。结合家蚕基因功能注释信息分析表明,有85个家蚕特有基因具有功能注释信息,鳞翅目特有基因有105个具有功能注释信息,这些具有功能注释的基因多是以基因家族形式存在,我们将其功能注释分为七大类。家蚕特有基因(含鳞翅目特有基因)中有1710个基因是以单拷贝形式存在,其它基因属于171个基因家族,如瘫痪肽家族、抗菌肽家族、表皮蛋白等。 2.家蚕特有基因时空及免疫表达模式分析 基于家蚕全基因组Oligo芯片数据,在2391个特有基因中,1535个基因具有对应的探针序列。分析这些基因在家蚕五龄3天各组织的表达情况显示,有567个基因至少在一个组织中检测到表达,其中,组织特异表达的基因有268个,推测这些基因可能与组织特异的生理途径相关；还有63个基因具有组织共表达特征。在早期胚胎芯片中共检测到468个基因表达,在早期胚胎中有近200个基因表达。对家蚕幼虫四龄发育时期芯片分析显示有623个基因检测到表达,有16个基因只在蜕皮期表达,推测可能与蜕皮过程相关；还有14个基因仅在食桑期表达。结合家蚕变态发育时期的芯片数据,结果表明家蚕特有基因中640个基因具有表达信号,大部分基因在雌雄中具有相似的表达模式,小部分基因的表达水平在雌雄中差异较大,推测与精子或卵子的发生与发育相关。基于大肠杆菌、黑胸败血、白僵菌和NPV四种微生物诱导的家蚕免疫芯片分析家蚕特有基因的诱导情况,结果显示有451个基因具有表达差异。 3.和用RNAi手段探索候选基因的功能 以具有EST证据、熟蚕期高量表达和单拷贝基因为筛选条件,筛选到13个候选基因,利用RNAi干扰实验初步探讨这些基因的功能。表型观察发现有6个基因得到了不同的表型改变,多数基因表现为蜕皮受阻,即无法蜕掉幼虫的皮。BGIBMGA000702基因取得较明显的表型变化,所有处理均可成功蜕皮,但是在RNAi处理后72h左右蛹的身体开始缩短,并逐渐死亡。对干涉个体进行解剖发现,相较于对照而言,处理后的蛹体液含量明显减少,其它组织没有明显变化,推测这个基因可能通过某种特殊的生理途径影响了蛹的发育,是蛹发育过程中的一个必需基因。实时荧光定量PCR显示该基因进行RNAi干涉处理后在mRNA水平表达下调,且与dsRNA处理后的雌蛹相比较,其在雄中表达量下调更明显。该基因在发育时期的RT-PCR表达谱显示其在熟蚕期开始表达上调且在雄中表达量较高,而蛹2天组织表达谱显示在各组织均有表达,并在卵巢、精巢和头中表达量较高。 4. BGIBMGA000702基因的原核表达及western blotting检测 信息分析发现BGBMGA000702基因由一个外显子组成,ORF框为588bp,编码195个氨基酸,蛋白预测分子量为23kDa,等电点为9.64,位于1号染色体上。将该基因整个编码区序列亚克隆到p28表达载体上构建重组表达质粒,并转化到Rosetta(DE3)表达菌株。通过IPTG诱导重组菌000702/p28/Rosetta(DE3)表达蛋白,得到一个约25kDa的重组蛋白,其中标签为6×His Tag约为2kD,目的蛋白约23kDa,与预测分子量相符合。蛋白组分鉴定表明该重组蛋白主要以包涵体形式表达。利用western blotting检测该蛋白在发育过程中的表达情况显示其在胚胎、熟蚕阶段高量表达；Western blotting检测RNAi干涉后蛋白表达情况表明该蛋白表达量明显下调,说明瞬时干涉可以引起该基因蛋白水平的表达下调。 综上所述,本文鉴定了家蚕、果蝇等六个昆虫基因组中特有基因及鳞翅目昆虫特有基因,并详细分析了家蚕和鳞翅目特有基因的序列信息及时空和免疫芯片表达谱,最后利用RNAi干扰实验和原核表达及western blotting初步探索了BGIBMGA000702基因的功能。本研究鉴定的家蚕特有基因将为家蚕特有的生理过程及生物特异性研究提供线索。