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抗BmNPV诱导型启动子转基因干涉载体的构建

李娜  
【摘要】: 家蚕核型多角体病是由家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nuclearpolyhedrosisvirus, BmNPV)感染家蚕所引起的一种传染性蚕病,是蚕业生产上的主要病害,极大地危害了蚕业生产。提高家蚕品种对病毒的抵抗性和培育抗病品种是防治传染性蚕病的有效措施。RNAi所介导的基因沉默能抑制病毒基因的复制,其与转基因技术相结合为培育抗病毒家蚕品种提供了新的方法。利用强的组成型启动子虽能提高RNAi效率,但是外源基因的组成性表达对转基因家蚕的发育会造成一定的影响。因此筛选合适的启动子,构建稳定表达dsRNA的载体,在提高dsRNA表达水平的同时减少外源基因组成性表达的负荷,将为最终获得具有BmNPV高度抗性的转基因家蚕育种素材奠定基础。本文通过荧光素酶报告基因载体pGL3对所选择的诱导型启动子(plef3和p39k)进行检测,构建了抗BmNPV诱导型启动子转基因干涉载体。主要的研究结果如下: 1诱导型启动子的选择与克隆 根据文献报道及杆状病毒的级联调控特征,对于BmNPV基因启动子进行分析,初步选择并克隆了39k基因和lef3基因的启动子区域。测序结果显示:所克隆的启动子均包含启动子转录核心区域,存在明显的杆状病毒启动子特征序列,含有TATA框,加帽位点,早期基因转录起始位点的保守序列(CAGT),翻译起始密码子ATG等,序列上符合真核生物启动子的特点。 2启动子活性检测 利用连接有BmNPV的39k及lef3启动子的荧光素酶报告基因重组载体pGL3-39k及pGL3-lef3转染Sf9及BmE-SWUl两种细胞,检测了两种启动子的活性。发现当在AcMNPV及BmNPV两种杆状病毒感染宿主细胞时,均会诱导BmNPV的39k启动子的活性上调。在异源细胞Sf9中的组成型活性较低,但病毒感染后的诱导活性会大大提高(相对酶活由0.411提高到64.9268,感染后约为感染前的158倍)。同样的,在宿主细胞BmE-SWUl被病毒感染后的39k启动子活性增加(相对酶活由6.0151提高到12.6497,感染病毒后约为感染病毒前的2.103倍)并且39k启动子活性在Sf9细胞中的组成型活性非常低,但在BmE-SWU1中组成型活性较高。而lef3启动子在有无病毒感染的情况时活性均远远低于39k启动子活性(P0.01)。进一步在BmE-SWUl细胞中测定了39k启动子在转染后各个时间点的活性,发现随着时间的推移,39k启动子的表达不断提高且感染BmNPV的组中39k启动子的活性明显高于未感染BmNPV的组中39k启动子的活性(P0.01) 3转基因RNAi干涉载体的构建及细胞水平上的抗病毒检测 分析确定了RNAi载体的结构,构建了可以在家蚕细胞中产生稳定的双链发夹状RNA(hpRNA)的转基因RNAi载体。进一步利用抗生素G418对于瞬时转染转基因载体的家蚕细胞进行筛选培养,近4个月后建立了稳定转化的转基因细胞系,接种Bm-BacPAK6病毒后,检测了病毒的增殖情况。研究表明:当用较高的病毒浓度滴度(1.014×1010PFU/mL—1.014×108PFU/mL)进行感染时,转基因细胞系在病毒感染前期(48-84h)具有显著的抗病毒效果(P0.01或P0.05)。而当用较低的病毒浓度滴度(1.014×107PFU/mL-1.014×106PFU/mL)感染时,转基因细胞系在病毒感染后期(84-108h)具有显著的抗病毒效果(P0.01或P0.05),表明干涉病毒效果与所感染的病毒浓度滴度和病毒增殖时间存在密切关系。


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