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家蚕Bmcaspase-9基因的克隆及表达分析

黄淑静  
【摘要】: 细胞凋亡是指在一定生理或病理条件下,细胞可按自身遗传基因的调控程序,结束自己的生命过程的一种正常生理现象。Caspase蛋白酶家族是细胞凋亡调控网络中的关键分子。本文通过生物信息学和分子生物学方法克隆了家蚕caspase-9同源基因,并进行了原核表达和多克隆抗体的制备;利用Western Blotting分析了Bmcaspase-9在正常细胞、UV诱导凋亡的细胞和ActD诱导凋亡的细胞中的表达量差异,得到了以下研究结果。 (1)Bmcaspase-9基因的克隆及序列分析 本研究克隆获得了caspase-9在家蚕中的两种同源体,分别命名为Bmcaspase-9L和Bmcaspase-9S。Bmcaspase-9L长度为1454bp,ORF长1245bp,含9个外显子,编码415个氨基酸,由Caspase募集结构域CARD,大催化亚基P20和小催化亚基P10组成,预测蛋白分子量为47.8kD,等电点7.66。Bmcaspase-9S长度为830bp,ORF长549bp,含5个外显子,编码183个氨基酸,仅由CARD和P10组成,缺少P20及QACR(orG/Q)G活性位点,预测蛋白分子量为21.4kD,等电点9.35。推测Bmcaspase-9S可能为Bmcaspase-9的变异体,为内源性Bmcaspase-9负调控分子,具抑凋亡功能。 应用musle.exe和MEGA4.0软件进行聚类分析,表明家蚕Caspase-9同源物与昆虫Caspase-9同源物聚为一类,与黑腹果蝇的Caspase-9同源物进化距离较近,与海胆类,鱼类,两栖类,鸟类和哺乳类的Caspase-9同源物进化距离远。Caspase-9同源物结构保守性较高,暗示了其功能的保守性及重要性。家蚕芯片数据分析表明Bmcaspase-9基因无组织与性别特异性,在雌蚕和雄蚕从熟蚕至蚕蛾不同发育时期以及家蚕大造品种5龄3天幼虫的体壁、血液、卵巢等10个组织(或样品)均有表达,但表达量均较低。这些时空的差异表达可能与家蚕的发育、分化和细胞凋亡有关。 (2)Bmcaspase-9的原核表达与多克隆抗体制备 将Bmcaspase-9L基因中编码第180至415个氨基酸残基的基因片段亚克隆到pET-28a-c(+)原核表达载体,转化BL21(DE3)诱导表达,并经镍离子亲和层析纯化靶蛋白,纯度达85%以上,以此为抗原制备了抗家蚕Bmcaspase-9的多克隆抗体。Western blotting检测原核表达的靶蛋白,表明融合蛋白具有家蚕Caspase-9的抗原性,抗体免疫特异性较高。 (3)Bmcaspase-9在家蚕BmE-SWU1凋亡细胞中的表达 经过紫外线和终浓度200ng/mL的放线菌素D处理24h,BmE-SWU1细胞发生了细胞凋亡。然后分别提取正常细胞、UV诱导的凋亡细胞和ActD诱导的凋亡细胞的总蛋白,采用Western Blotting在三组样品中均检测到了Bmcaspase-9蛋白。正常细胞与两组诱导凋亡的细胞中Caspase-9的表达量几乎一致。这可能是由于Bmcaspase-9蛋白本身以无活性的酶原形式存在于正常细胞中,凋亡信号刺激后自剪接而激活,最终导致细胞凋亡,但在整个凋亡事件中其表达量上调并不明显。在正常、UV诱导凋亡和ActD诱导凋亡的细胞中均检测到了家蚕Pro-caspase-9蛋白,并在两组诱导凋亡的细胞中均检测到了Caspase-9活化片段。所以推测UV和ActD诱导发生的细胞凋亡可能一起了Caspase-9的活化。


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