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黄瓜类金属硫蛋白2(CsMT-L2)的原核表达与金属螯合能力研究

翟军鹏  
【摘要】: 金属硫蛋白(Metallothionein, MT)是一类低分子量、高Cys含量、具有金属结合能力的多肽,最早在蓄积镉的马肾组织中发现,而在植物中分离的与动物MT同源的蛋白被称为植物类金属硫蛋白(Metallothionein Like, MT-L)。根据Cys的位置与排列方式,植物类金属硫蛋白被分为三类。Ⅰ类与Ⅱ类MT的最大区别在于前者的Cys集中分布在肽链的N端和C端,中间由一段不含Cys的间隔区相连,后者的Cys则散布在整个肽链中;而第Ⅲ类MT为非基因编码产物,是以谷胱甘肽为底物酶促合成的多聚物。目前对植物类金属硫蛋白的结构与功能的研究还不够深入,普遍认为其与金属结合有关。 黄瓜类金属硫蛋白2(CsMT-L2)基因由本实验室在黄瓜果实cDNA文库分析中得到鉴别和克隆,其功能尚未得到研究。本研究将该基因在原核中表达,分析其表达的蛋白对金属离子的螯合能力,并与人的金属硫蛋白的β结构域和类植物螯合肽相比较;同时,将CsMT-L2的两个富含Cys的区域直接相连,构成中间连接区缺失突变体CsMT-L2m,探讨该蛋白中间连接区的功能。该研究将为深入揭示金属硫蛋白的结构与功能的关系提供理论依据,阐明Ⅰ类植物类金属硫蛋白的中间连接区的作用,为该基因的应用研究奠定基础。主要结果如下: 1.成功构建4个相关原核表达载体。 利用高保真PrimStar HS DNA聚合酶,通过PCR扩增得到4个相关基因,分别连接到pET32a+原核表达载体多克隆位点区域,经过酶切、测序验证,4个基因成功插入载体中并且可读框正确。 2. CsMT-L2、CsMT-L2m、HsMT-L2和PcL等4个融合蛋白在原核表达中得到了大量表达。 四个融合蛋白经过原核表达、MagneHisTM蛋白纯化系统纯化、SDS-PAGE电泳检测、S-TagWestern Blot,均得到了预期大小的目的条带。 3.证实了4种融合蛋白在大肠杆菌体内具有金属螯合能力。 通过火焰原子光谱法测定结合Zn2+、Cd2+金属含量,CsMT-L2、CsMT-L2m、PcL、HsMTb融合蛋白在菌体内吸附Zn2+能力分别为1.37x10-5mol/g、0.693x10-5mol/g、0.948×10-5 mol/g、0.911x10-5mol/g,而CsMT-L2、CsMT-L2m、HsMTb、PcL融合蛋白在菌体内吸附Cd2+能力分别为1.25×10-4 mol/g、3.43x10-5mol/g、1.15×10-5 mol/g、7.67x10-5 mol/g,均明显高于对照组(p0.01),说明四种蛋白都具有金属结合的能力,但是四个相关蛋白金属结合能力是有明显的差异,其中CsMT-L2结合Zn2+、Cd2+能力最强,PcL次之,可能与结构有关。其中,改造的金属硫蛋白(CsMT-L2m)金属结合能力明显下降(尤其Cd2+的影响较大),说明中间连接区对于两个富含Cys区域之间的协调以及整个构象正确折叠发挥重要的作用。 4.明确了蛋白CsMT-L2与CsMT-L2m的信号肽、跨膜区、磷酸化位点和高级结构。运用生物信息学的方法和软件对其信号肽、跨膜区、磷酸化位点、二、三级结构、分子进化关系等重要参数进行预测和推断。结果表明:CsMT-L2与CsMT-L2m为无信号肽蛋白,非分泌、非跨膜蛋白,CsMT-L2包含三个磷酸化位点,CsMT-L2没有磷酸化位点,CsMT-L2的二级结构由Alpha helix(Hh、Extended strand (Ee)、Random coil(Cc)三种形式构成,其中Alpha helix(Hh)占11.84%、Extended strand (Ee)占9.21%、Random coil(Cc)占78.95%。CsMT-L2m的二级结构全部是无规则卷曲。CsMT-L2的三维模型符合hairpin模型。


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