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病原微生物黑胸败血芽孢杆菌(Bacillus bombyseptieus)等诱导家蚕(Bombyx mori)全基因组寄主应答研究

黄璐琳  
【摘要】: 在漫长的进化历程中,病原微生物与寄主之间形成了复杂的相互关系。黑胸败血芽孢杆菌(Bacillus bombyseptieus, Bb)是家蚕细菌性败血病的主要病原之一,1931年被分离鉴定。但迄今为止,Bb感染家蚕的分子病理、分子免疫等科学问题从未阐明。与之相似,典型的真菌病原球孢白僵菌(Beauveria bassiana)与家蚕相互作用的分子机制也尚不清楚;虽然BmNPV感染家蚕细胞的研究报道较多,但从个体水平系统分析BmNPV为代表的病毒感染家蚕引起的寄主应答机制也未阐明。 本研究在家蚕基因组信息的基础上,利用Bb感染家蚕的生物模型,主要采用基因芯片技术,探索了Bb感染家蚕后引起的分子病理、免疫应答模式和致病机理。在此基础上,采用同样的方法,比较分析了白僵菌、BmNPV、Bb和E.coli感染家蚕引起的基因表达调控关系。获得的主要结果如下: (1)家蚕黑胸败血病病原-黑胸败血芽孢杆菌(Bacillus bombyseptieus, Bb),菌体大小为1-1.5μm×2.5-3gm,以单个、多个、短链或长链存在,能产生芽孢和伴孢晶体,添食感染能诱导家蚕死亡。克隆它的16S rRNA基因与NCBI己报道的同源序列比对和进化分析表明,Bb16S rRNA基因进化枝较长,这可能是由于它长期的独立进化所致。在进化关系上,它与蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的亲缘关系较近,而与炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)等种属的亲缘关系较远。 (2)Bb添食感染家蚕能诱导家蚕强烈的寄主应答。在添食后的各个时间点(3h、6h、12h和24 h),Bb都诱导了大量有功能活性的酶类等编码基因表达,全基因组应答在感染后24 h达到高峰。在Bb诱导家蚕的过程中,大约占基因组17%的基因(2,436个)被诱导表达。KEGG分析发现,Bb诱导了大量基本代谢通路相关基因,包含遗传物质的加工和转录(包括RNA聚合酶和基本转录因子)、核苷酸代谢(包括嘌呤和嘧啶代谢)、外来物质的生物降解(包括2,4-D降解、苯甲酸通过羟基化降解、苯乙烯降解)、氨基酸和氮代谢(包括色氨酸代谢、组氨酸代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解、尿素循环代谢和氨基酸代谢、氨基磷酸酯代谢、氮代谢),以及糖类代谢(包括戊糖和糖醛酸转换、三羧酸循环、丙酮酸代谢、磷酸戊糖途径、丁酸代谢)等多种基本代谢通路相关基因。参与这些基本代谢通路的基因,大部分上调表达,表明在Bb诱导家蚕后,寄主家蚕的物质和能量代谢加速进行,推测这是为了满足家蚕自身生存以及被迫为Bb提供物质和能量的结果。 (3)无论是病毒病原BmNPV,还是真菌病原B.bassiana,都与革兰氏阳性细菌Bb一样,添食感染能引起家蚕强烈的寄主应答。比较这三种病原与非病原菌E.coli的诱导,病原菌的诱导强度更大,在4个时间点的感染过程中,分别有1804、2436和1743个基因被BmNPV、Bb及B.bassiana诱导表达,非病原菌E.coli诱导了912个基因表达,与病原比较相对较少。 基因的表达总是由一系列的转录调控激活,调查在家蚕中鉴定的665个转录因子,Bb诱导的转录因子数量相对最多(68个),B.bassiana和BmNPV次之(分别为60个和56个),E.coli最少(27个),都包含了基本转录因子和其它转录因子。 基因的诱导表达模式分析表明,从转录因子到其它基因表达,病毒BmNPV呈现了与众不同的诱导表达模式,主要表现在诱导的较早期(6h)强烈的寄主应答反应。而其它三种微生物的诱导表达模式比较相似,它们在诱导前中期(3 h-12h)的诱导反应较小,而在诱导后期24 h达到最高峰。 比较四种微生物诱导的基因,它们之间有共通性,也有差异性。在发育相关的信号传导方面,JH、Wnt、MAPK、P53和cell cycle通路相关的生长因子、受体和必须复合物相关基因都在感染过程中不同程度被诱导表达。在基本代谢通路方面,包括-炭库叶酸、组氨酸代谢和色氨酸代谢相关基因被四种微生物都显著诱导,显示对微生物袭击较敏感。病原微生物具有诱导寄主致病的共性,共有7个基本代谢通路相关基因被病原特异诱导,它们是:异源物质的生物降解及代谢(羟基苯甲酸通过羟基化降解)、碳水化合物代谢(丙酮酸代谢)、核苷酸代谢(嘌呤代谢),能量代谢(氮代谢)、氨基酸代谢(尿素循环和氨基酸代谢)及辅因子和维生素代谢(泛酸和辅酶A合成、卟啉和叶绿素代谢),提示这些基本代谢通路对病原感染较敏感。在病理发生相关方面,包括细胞骨架、角质层相关蛋白、呼吸链、金属蛋白酶、蛋白水解酶家族等相关基因被诱导表达。在分子免疫方面,四种微生物不同程度的诱导了家蚕免疫信号识别、信号调节和效应因子等免疫相关基因上调表达,显示能激活家蚕的免疫应答。 (4)对Bb引起的家蚕免疫相关基因分析表明,它可引起家蚕的细胞免疫、多酚氧化酶黑化级联,以及系统性免疫应答。在这些过程中,溶菌酶、凝集素、清道夫受体、铜/锌超氧化物歧化酶、免疫球蛋白超家族、肽聚糖识别蛋白、β-glucan识别蛋白、硫酯蛋白、CLIP丝氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂(SPNs)、PPO、Toll信号通路JAK/STAT通路、抗菌肽Attacin、Enbocin、Gloverin、Lebocin和Moricin家族的部分基因都被诱导上调表达,提示Bb能引起家蚕较强烈的免疫应答反应。 (5)对Bb感染家蚕的致病机制初步分析表明,Bb感染家蚕的致病性与Bb较相似。推测该模型如下:首先,Bb及其携带的毒素进入家蚕中肠,毒素释放,被寄主中肠的蛋白酶如丝氨酸蛋白酶等所消化激活,破坏家蚕的中肠围食膜,与寄主中肠上皮细胞微绒毛上的APN受体结合,由此进入细胞膜,在细胞上形成孔洞,破坏细胞。最后导致寄主家蚕的渗透平衡和细胞内外物质交换平衡受到破坏;细菌及毒素通过中肠上皮细胞的孔洞进入血淋巴,引起中毒性败血病,最终导致家蚕死亡。


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