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山茶‘耐冬’愈伤组织诱导与植株再生的研究

吴斌  
【摘要】:‘耐冬’为常绿阔叶灌木或小乔木,山茶科山茶属植物,主要分布于青岛崂山及长门岩等岛屿,为我国山茶自然分布的最北端。‘耐冬’四季常青,花色艳丽,花型优美,花期持久,傲雪凌霜,其种苗目前仍以传统的籽播、扦插、嫁接等方式繁殖为主。但因其分布狭窄,种子和种苗来源严重不足,难以满足种苗和商品苗市场的需求。 本项目主要以‘耐冬’子叶作为外植体,对其愈伤组织再生植株了系统地研究,并获得了优化的‘耐冬’未成熟果消毒方式及时间、有效防止‘耐冬’试验材料(上、下胚轴,茎段及根段等)褐变的方法、‘耐冬’愈伤组织诱导的培养条件、‘耐冬’愈伤组织诱导、增殖以及不定芽分化的激素搭配,‘耐冬’再生植株的生根方式以及驯化、移栽方法。主要研究结果如下: ⑴‘耐冬’未成熟果消毒方式及时间 对较幼嫩的山茶未成熟果连同果皮消毒,而成熟的山茶果则剥去果皮后对成熟胚进行消毒;500mL的0.1%HgCl2在配制时添加10ml吐温20以及2~3滴1mol·L~(-1)的HCl溶液;使用该种升汞溶液消毒8min,再用无菌水冲洗5~6遍,清洗完毕后将未成熟果/种子铺在有滤纸的培养皿里,待吹干材料表面水分后再进行下一步实验操作,可获得较佳的消毒效果。 ⑵‘耐冬’试验材料抗褐变的有效方法 在培养基中添加0.2%的PVP,并将其置于弱光条件下培养,可以有效防止外植体的褐变情况。 ⑶‘耐冬’愈伤组织诱导的培养条件以及激素配比优化 通过DPS软件进行3因素4水平的正交试验设计,研究蔗糖浓度、生长素与细胞分裂素配比对‘耐冬’愈伤组织的诱导率的影响,试验结果表明:在光照条件下,优化后的蔗糖浓度及激素配比为MS+30g·L~(-1)蔗糖+0.5mg·L~(-1)2,4-D+0.5mg·L~(-1)6-BA,其愈伤组织诱导率最高可达94.5%;在黑暗条件下,优化后的蔗糖浓度及激素配比为MS+50g·L~(-1)蔗糖+1.0mg·L~(-1)2,4-D+2.0mg·L~(-1)6-BA,其愈伤组织诱导率最高可达98.57%。黑暗条件下培养诱导的愈伤组织的诱导时间较光照条件下的更短,生长量更大,且诱导率更高;但光照条件下的愈伤组织状态更利于不定芽的分化。 ⑷‘耐冬’愈伤组织增殖与不定芽分化诱导激素配比的优化 优化后的愈伤组织增殖培养基为MS+0.1mg·L~(-1)NAA+2.0mg·L~(-1)6-BA;经过2次转接继代培养后,将质地密实、奶黄色或淡黄色、表面富有水润光泽的愈伤组织转入不定芽分化培养基MS+0.5mg·L~(-1)NAA+10.0mg·L~(-1)6-BA进行不定芽的分化诱导,不定芽的分化率达34.32%。 ⑸‘耐冬’不定芽的生根 ‘耐冬’不定芽的生根诱导方法是将切割为单芽的芽条基部浸没在500mg·L~(-1)的IBA溶液中60min,再转接到MW液体培养基的滤纸桥上,于弱光(100~200μmol·m-2·s~(-1))下培养,生根率达50%。


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