喹诺酮类抗生素与生物大分子的相互作用的荧光法研究

【摘要】： 近年来,由于抗生素滥用而引起的环境污染问题越来越严重,环境中残留的大量抗生素的环境行为及其对生物体的具体影响与危害已经成为环境科学的重要研究方面,尤其缺乏分子层面的相关机理研究。 本文结合分子发光光谱中的三种方法,即荧光猝灭法、同步荧光法和荧光共振能量转移光谱法,从分子层面研究环境中残留的抗生素与大型生物体中重要的生物大分子——消化酶的相互作用机理,通过实验得到了喹诺酮类抗生素与生物大分子结合的理论数据,为今后进一步研究抗生素对大型生物体的具体危害,研发环境友好型抗生素提供了理论基础。本文还利用生物大分子与分子发光光谱探针结合的特性建立了新的分析方法,为环境科学中关于生物大分子的微观研究领域做了一些基础工作。 本文主要利用分子荧光光谱法的荧光猝灭理论及荧光共振能量转移理论,选取喹诺酮类抗生素中的具有代表性的氧氟沙星、依诺沙星、乳酸左氧氟沙星,在实验室条件下,研究其与消化酶的相互作用。结果表明在消化酶浓度一定的条件下,随着喹诺酮类抗生素浓度的增加,消化酶的内源荧光强度有规律地降低,氧氟沙星与乳酸左氧氟沙星的最大发射波长的荧光强度有规律的增加,而依诺沙星的最大发射波长的荧光强度保持不变。说明喹诺酮类抗生素与消化酶中的色氨酸、酪氨酸残基发生了相互作用,并且消化酶与氧氟沙星、乳酸左氧氟沙星共同构成了新的分子刚性结构而发生了能量转移现象。进一步通过荧光猝灭理论的讨论得出,喹诺酮类抗生素与消化酶的相互作用属于静态猝灭,结合荧光共振能量转移理论与化学热力学讨论,分别得出三种喹诺酮类抗生素与消化酶的成键类型与结合的位点数。 本文利用荧光共振能量转移光谱法建立了一个新的荧光共振能量转移体系,在λex/λem=400/530nm, 0.1mol/L的Tris-HCl溶液(pH=7.0),异硫氰酸荧光素和罗丹明6G能够发生有效的荧光共振能量转移,使得罗丹明6G荧光大大增强,同时异硫氰酸荧光素的荧光猝灭.而BSA的加入使得罗丹明6G的荧光强度减弱并且BSA的加入量与体系的FD/FA呈良好的线性关系,由此建立了一种新的测定的BSA的方法。研究结果表明,BSA的含量在10mg/L-35mg/L范围内与染料的荧光强度减弱程度呈良好的线性关系,方法最低检出限为9.5mg/L;该法用于合成样中BSA的测定,回收率为96.5%。 本文同样建立了以罗丹明123和罗丹明B染料对为供受体的新的荧光共振能量转移体系,在该体系中加入BSA,发现在加入BSA后罗丹明123和罗丹明B的荧光强度都明显降低,且BSA的加入量与罗丹明123和罗丹明B体系的荧光猝灭程度呈良好的线性关系.据此提出了罗丹明123和罗丹明B能量转移体系测定BSA的新方法。实验表明,在λex/λem =478/580 nm,0.1mol/L的Tris-HCl溶液(pH=7.0)Tris溶液(pH=7.0)存在下,罗丹明123和罗丹明B能够发生有效的荧光共振能量转移。BSA含量8mg/ml～23mg/ml的范围内与体系猝灭程度呈良好的线性关系,方法的最低检出限为8.6mg/mL.应用该体系测定了合成样中的BSA含量,回收率达到92.3%。 本文运用分子荧光光谱法的荧光猝灭理论初步探索了喹诺酮类抗生素与生物大分子结合反应的化学机理,为其毒理分析做了一些基础研究工作,为寻找测定抗生素的光谱探针提供了理论依据。同时本文还研究了荧光共振能量转移光谱法在保持活性的生物大分子测定中的应用,本文建立的这些新方法灵敏度高、选择性好、简便快速,成本低廉,具有实际应用价值,同时也对新方法的作用机理进行了探讨。