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草鱼肝胰脏淀粉酶的纯化及理化性质的研究

赵春彦  
【摘要】:α-淀粉酶是消化酶的一种,属于水解酶类,是α-淀粉酶家族(EC 3.2.1.1)中的重要成员。α-淀粉酶是最重要的工业酶制剂之一,广泛应用于食品工业、淀粉加工业、纺织工业、发酵工业和医药行业等。目前α-淀粉酶制剂主要来由微生物发酵产生,而来源于动物和植物的淀粉酶还很少。 鱼类淀粉酶的相关研究可为人工配合饵料提供相关信息,也可为一直作为下脚料的鱼类内脏的合理回收利用提供理论基础。可是到目前为止,还未见草鱼淀粉酶纯化和性质研究报道。本研究主要是对草鱼淀粉酶进行分离纯化,并对其性质进行了分析,具体研究如下: 1.草鱼淀粉酶的纯化 草鱼肝胰脏粗酶液首先用30-60%硫酸铵进行分级沉淀,然后所得粗酶液上疏水层析,最后经Sephadex G-100凝胶层析纯化得到纯酶。测得草鱼淀粉酶的最终的产率为24.4%,纯化倍数达到了约70倍。纯化所得淀粉酶用10%的分离胶和5%的浓缩胶进行常规聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)和十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),电泳结果显示淀粉酶均呈现单一条带,说明淀粉酶已经得到纯化,并且此淀粉酶为单亚基的蛋白,测得草鱼淀粉酶的分子量为98KDa。 2.草鱼淀粉酶的性质研究 以不同浓度的可溶性淀粉为底物,利用3,5-二硝基水杨酸法(DNS法)测得草鱼淀粉酶的动力学常数(Km)为0.00725mg/ml。 以可溶性淀粉为底物在不同的温度和pH条件下用DNS法测得草鱼淀粉酶的最适反应温度为55℃,最适反应pH为8.0,在60℃以下活性较稳定,淀粉酶在pH5.0-9.0范围内较稳定,淀粉酶在弱酸弱碱条件下活性丧失比较慢,强碱条件不稳定。 纯化后的淀粉酶液分别加入不同浓度(1mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L)的金属离子(Na~+、K~+、Ca~(2+)、Mg~(2+)、Zn~(2+)、Cu~(2+)、Pb~(2+)、Ag~(2+)、Al~(3+))和不同浓度(1mmol/L、5 mmol/L、50 mmol/L)的抑制剂SDS、EDTA处理30min后,以可溶性淀粉溶液为底物测定处理后淀粉酶的活力。结果表明Ca~(2+)能强烈的激活淀粉酶活性,低浓度的Cu~(2+)(5mmol/L、10mmol/L)对草淀粉酶活性有促进作用,而Ag+、Zn~(2+)、Pb~(2+)、Al~(3+)和低浓度Mg~(2+)(5mmol/L、10mmol/L)、高浓度Cu~(2+)(50mmol/L)对草鱼的酶活性有抑制作用,高浓度Al~(3+)(50mmol/L)完全抑制淀粉酶活性。K~+和Na~+对草鱼淀粉酶的活性影响不大。高浓度EDTA(50mmol/L)完全抑制淀粉酶活性;SDS对草鱼淀粉酶活性有部分抑制作用。 3.草鱼淀粉酶对可溶性淀粉和生淀粉的水解能力的研究 在离体条件下测定了纯化的淀粉酶对可溶性淀粉的水解能力,在作用30min后可溶性淀粉生成的还原糖占干物质总量的23%,说明淀粉酶能够比较快速有效的降解可溶性淀粉。对生红薯淀粉、小麦淀粉和玉米淀粉的离体水解能力研究结果表明对三种来源的生淀粉的水解能力都很低,其中对玉米生淀粉的水解能力最强,对红薯淀粉的水解能力最差。


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