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河川沙塘鳢胚胎、仔鱼发育过程中孵化腺的超微结构及其孵化酶(HCE)mRNA的定量研究

罗颖  
【摘要】: 河川沙塘鳢(Odontobutis potamophila),隶属鲈形目(Perciformes),沙塘鳢科(Odontobutidae),是我国重要的淡水经济鱼类之一。在河川沙塘鳢的生物学、胚胎发育、器官发育等相关研究基础上,本文采用透射电镜对河川沙塘鳢胚胎发育过程中孵化腺的超微结构进行了观察,并利用分子生物学的研究方法进一步对河川沙塘鳢孵化酶(HCE)基因的部分序列进行了克隆和分析,测定了河川沙塘鳢胚胎、仔鱼发育过程中孵化酶(HCE)基因mRNA的转录水平,同时探究了其与孵化腺发生之间的时空关系。 河川沙塘鳢的孵化腺为单细胞腺体,最早可在眼晶体形成期观察到孵化腺细胞(Hatching gland cells,HGCs),主要分布于头部腹面、头部与卵黄囊连接处及其卵黄囊前腹面;当胚胎发育至血液循环期时,HGCs不仅在形态上达到最大,数量上急剧增多,而且分布更广泛;胚胎发育进入眼黑色素出现期时,可以观察到处于不同合成时期的酶原颗粒,每个酶原颗粒外面均有膜包围,颗粒之间有明显的界限;当胚胎发育至孵化前期时,HGCs在数量上达到最多,并且可以观察到呈圆球形、直径约为0.25~1.00μm的孵化酶颗粒自HGCs顶部的开口处向外分泌,这些颗粒有些以单体形式存在,有些则粘结成团;初孵仔鱼期,已完成分泌作用的HGCs离开胚胎表面,转移至表皮细胞下方并逐渐衰退。以上结果表明,河川沙塘鳢孵化酶颗粒有一个成熟过程,成熟的孵化酶颗粒主要通过外倾方式向卵周隙中分泌以帮助胚胎的孵化破膜。 用Trizol提取到河川沙塘鳢的总RNA,测得A280 / A260均在1.8~2.0之间,通过AMV逆转录体系获得其cDNA。以RNA为模板,根据相关文献设计的引物进行PCR得到了长度为84bp的基因特异性cDNA扩增片段。所获得的扩增片段经过序列比对、同源性分析,表明所获扩增片段的确为孵化酶(HCE)基因的cDNA片段。 随后,采用实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction, RFQ-PCR)的方法研究了河川沙塘鳢胚胎、仔鱼发育过程孵化酶(HCE)基因mRNA表达量的动态变化。研究结果显示,从受精卵期到眼晶体形成期的早期发育阶段,孵化酶(HCE)基因mRNA的表达量较低(以孵化前期表达量为标准1);在眼黑色素形成期时,其表达量达到最大值;随着胚胎的进一步发育,仔鱼的出膜,孵化酶(HCE)基因mRNA的表达量逐渐降低;但当仔鱼发育到一日龄时,孵化酶(HCE)基因mRNA的表达量又有所增长,随后孵化酶(HCE)基因mRNA的表达量又一次降低。孵化酶(HCE)基因mRNA表达量的变化趋势与孵化腺细胞在超微结构上的形态变化结果大体一致。这表明在河川沙塘鳢的胚胎、仔鱼发育过程中,孵化酶(HCE)基因mRNA的表达存在着动态的变化,且与孵化腺的发生以及孵化酶的分泌过程存在着时空相关性。


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