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牦牛β-防御素5基因的原核表达及乳腺特异性表达载体的构建

符梅  
【摘要】:本研究以牦牛β-防御素5基因为研究对象,分别对牦牛β-防御素5基因进行原核和真核表达研究。原核表达以pET-32a(+)为表达载体,将构建好的重组原核表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,检测其重组蛋白的体外抑菌活性。真核表达以奶牛β-酪蛋白基因(β-casein,CSN2)5'端和3'端为调控成分,牦牛β-防御素5基因CDS区为表达序列,构建牦牛β-防御素5基因乳腺特异性表达载体,将表达载体导入体外培养的牦牛乳腺上皮细胞,分析牦牛β-防御素5基因的表达效率。具体如下: 1.采用RT-PCR方法从牦牛肺组织中扩增牦牛BNBD5基因成熟肽编码区及BNBD5基因开放阅读框。PCR产物经胶回收纯化后,克隆于pMD19-T载体的T位点。测序结果表明,获得了138bp的BNBD5成熟肽编码片段及219bp的开放阅读框,成熟肽编码45个氨基酸残基,内含6个位置保守的半胱氨酸残基。经遗传进化分析发现,该基因的序列与牛的mRNA同源性最高,可达到86.2%。 2.将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21,于37°C06h间进行诱导表达,SDS-PAGE检测融合蛋白表达情况,并对该重组蛋白进行纯化测定其体外抗菌活性。结果表明,经IPTG诱导,获得了分子量约为25kDa的牦牛β-防御素5基因成熟肽融合蛋白。琼脂糖扩散法表明,0.08mg/mL的纯化蛋白对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌有抗菌作用。 3.利用普通PCR法扩增了奶牛CSN25'端1947bp(包括1.7kb的上游调控序列以及5'不翻译区的第一个外显子)、3'端620bp(包括最后一个内含子、最后一个不翻译的外显子和150bp的侧翼)调控区及牦牛β-防御素5基因的开放阅读框,并利用双酶切定向克隆的方法,将他们克隆于pEGFP-C1真核表达载体上,构建了牦牛β-防御素5基因乳腺特异性表达载体。 4.采用脂质体转染的方法将构建的牦牛β-防御素5基因乳腺特异性表达载体导入体外培养的牦牛乳腺上皮细胞中,经新霉素抗性基因(G418)初步筛选后,借助荧光显微镜观察到了绿色荧光蛋白(GFP)基因的表达。通过设计一对特异性引物,对初步筛选的阳性克隆进行检测,结果表明,表达载体已整合到乳腺上皮细胞的染色体中,证明了构建的乳腺特异性表达载体的可行性。


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