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虫生真菌鹿儿岛被毛孢对两种昆虫激素的应答研究

瞿娇娇  
【摘要】:真菌类杀虫剂是生物农药产业的重要组成部分,是一类寄主谱较广的虫生真菌,可通过直接穿透昆虫体壁杀虫,具高度特异性、对环境安全,但由于易受环境影响而限制其应用。因此为克服虫生真菌的这些缺陷、改良菌株性状,充分理解虫生真菌对寄主致病各个环节的作用机理是重要的理论基础。目前真菌在昆虫体腔内定殖机理研究发现,昆虫激素能调控昆虫的免疫反应,但虫生真菌在血体腔定殖过程与昆虫激素是否存在直接联系尚不明确。课题组前期研究发现,蜕皮激素和保幼激素能引起虫生真菌鹿儿岛被毛孢表型的变化,激素诱导能显著增加该菌色素产生和孢外粘液的厚度。本论文根据昆虫激素能调节被毛孢的孢外粘液分泌这一现象入手,通过比较转录组学和孢外粘液蛋白表达谱的联合分析,从分子层面解析了鹿儿岛被毛孢在寄主体内定殖过程中应对昆虫蜕皮激素(20E)和保幼激素(JH)压力而产生的具体应答分子机理。除了分泌蛋白上调表达,鹿儿岛被毛孢中一些昆虫激素代谢类基因和凝集素类蛋白也参与应答过程。首次从20E诱导产生差异表达的基因中分离鉴定出1个蜕皮激素失活酶Hsegt基因,并进一步研究了该基因的功能。凝集素类蛋白也有参与应答过程,从20E处理组分离鉴定一个具有凝血活性的蛋白Hscal1,功能研究表明该蛋白能结合Ca~(2+)发挥活性并特异性识别海藻糖。这些主要结果表明鹿儿岛被毛孢与两种昆虫激素之间存在直接的相互作用关系,昆虫激素也是虫生真菌在昆虫体腔定殖时的胁迫压力之一,为应对激素引起的昆虫生理胁迫,真菌进化出了特异性的应对策略。论文为探究虫生真菌在昆虫体内定殖机制提供了新的线索。所取得的主要研究结果如下:1.鹿儿岛被毛孢应答两种昆虫激素的分子基础鹿儿岛被毛孢与蜕皮激素和保幼激素存在直接相互作用关系。模拟家蚕体内激素的中浓度水平,将400 ng/mL浓度的蜕皮激素和250 ng/mL的保幼激素对鹿儿岛被毛孢进行诱导培养后,通过转录组和蛋白组联合分析。结果发现,两种激素诱导下产生的大部分差异基因与寄主互作相关,说明对激素的应答是真菌在昆虫体腔定殖的重要环节之一。该菌对20E的应答主要集中在脂质代谢及氨基糖类代谢等重要生物学过程;而JH处理组差异表达基因主要参与了核糖体的合成代谢及蛋白的转录与翻译过程。另外胞外分泌蛋白也参与应答反应,两个处理组共表达蛋白共有45个,大部分蛋白均上调表达,这吻合粘液厚度增加的表型现象。鹿儿岛被毛孢应答昆虫激素存在特异性的应对策略。从转录组和蛋白谱中共筛选出三类可能对激素有重要应答作用的基因:(1)昆虫激素代谢基因,从差异基因的次级代谢途径中发现两条昆虫激素代谢相关途径,并首次从该菌中筛选出昆虫激素代谢相关基因,包括2类蜕皮激素失活酶(EGT和EcKinase)和保幼激素合成途径中一个关键醛脱氢酶,分别受两种昆虫激素的诱导而高表达。这类基因的发现进一步验证了虫生真菌与昆虫激素之间的直接作用关系。(2)寄主家蚕高度同源的分泌性蛋白,包括Fibrohexamerin和Sericin 1等丝蛋白,受保幼激素诱导而显著性高表达,可能与免疫逃避有关;(3)凝集素类蛋白,该菌中一共筛选出4个与激素应答相关凝集素,参与对寄主识别。2.鹿儿岛被毛孢胞外粘液成分及对孢子表面性质的影响粘液影响孢子粘附和毒力。采用温和洗脱的方法提取胞外粘液并优化提取条件,鹿儿岛被毛孢分生孢子粘液蛋白的最优提取方法为:孢子浓度在5×10~7conidia/mL左右,2 mM的二硫苏糖醇(DTT),低温提取24 h。粘液提取后能显著影响孢子细胞表面性质,使孢子表面疏水性和黏附率下降;同时降低了孢子对大蜡螟和小菜蛾两种试虫的毒力。这可能是由于黏液中参与粘附识别、附着胞形成蛋白和昆虫体壁降解酶被破坏,进而导致毒力下降。粘液成分与其功能联系紧密。利用Label-free法鉴定正常生长状态下孢子的粘液蛋白谱,并与转录组联合分析发现,鹿儿岛被毛孢的野生型孢外粘液共鉴定出474个蛋白,其中7个与黏附相关、13个与寄主体壁破坏及附着胞形成相关、9个与逆境防御机制相关。粘液中还含有包括中性糖、碱性糖和碱不溶性糖等糖类,这些糖类可能是以糖-蛋白结合的方式存在,在昆虫体腔中与真菌细胞壁重塑和蛋白糖基化相关。粘液中含有凝集素类蛋白。采用非变性的方法对鹿儿岛被毛孢分生孢子的孢外粘液进行提取,粘液粗提物具有凝血活性;进一步分离纯化,从Sephades G-100分子筛层析中得到一个具有较高凝集活性的蛋白组分Sl(128 unit);SDS-PAGE检测该组分的分子量为32 KDa。对该组分进行质谱鉴定,得到一个Legume-like lectin(HSL)蛋白,具凝集活性。凝集素能够参与细胞的识别和粘着,说明粘液也参与寄主识别黏附过程,进一步验证了粘液能影响孢子毒力。3.重要应答基因蜕皮激素失活酶Hsegt基因和凝集素蛋白Hscal1的功能研究构建了鹿儿岛被毛孢遗传转化体系。筛选出了鹿儿岛被毛孢敏感的抗性标记:除草剂草铵膦(Phosphinothricin,PPT)和氯嘧磺隆(Chlorimuron ethyl,sur),并确定了PPT对鹿儿岛被毛孢的抑制浓度为0.5μL/mL;sur的抑制浓度为150μg/mL。优化了根癌农杆菌介导转化鹿儿岛被毛孢的方法,成功将绿色荧光蛋白和HtA毒力蛋白的过表达载体转入该菌野生型菌株并稳定表达,基于此方法成功构建了鹿儿岛被毛孢的遗传转化体系。Hsegt基因的功能研究。对重要应答基因Hsegt进行了生物学功能分析,该基因被注释为一种蜕皮激素失活酶(Ecdysteroid UDP-glucosyl transferase),属于egt superfamily,这是首次在虫生真菌中发现这类蜕皮激素失活酶。基于鹿儿岛被毛孢的遗传转化体系,获得了Hsegt基因的敲除(ΔHsegt)、过表达(OE-Hsegt)及回复(Comp)菌株。该基因的功能研究表明,Hsegt基因的敲除对菌株的毒力无影响,但超量表达后增强了菌株的毒力;Hsegt基因过表达具有20E失活作用,在鹿儿岛被毛孢中的上调表达能抑制虫体内20E的浓度,同时也能抑制虫体相关抗真菌基因的上调表达和酚氧化酶活性,进一步削弱寄主的免疫反应,使其体内细菌生长失去平衡、大量繁殖,加速寄主死亡。Hscal1蛋白的功能研究。从转录组和蛋白组中同时筛选出一个凝集素类蛋白(c7951),对蜕皮激素有特异性响应。对其进行生物信息学分析,该蛋白被注释为Concanavalin A-like lectin/glucanase,属于C-Type Lectin家族,具有Ca~(2+)结合位点,将其命名为Hscal1;随后进行体外表达,得到分子量为45.21 kDa的蛋白,该蛋白具有凝血活性,能结合Ca~(2+)发挥活性并特异性识别海藻糖,可能参与了真菌在昆虫体腔内的营养识别与代谢。说明凝集素类蛋白参与鹿儿岛被毛孢对蜕皮激素的应答过程。


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