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花榈木体细胞胚胎发生诱导及其机理研究

吴高殷  
【摘要】:花榈木(Ormosia henryi Prain)是我国特有的珍贵树种,是制作高档家具和工艺品的原材料,其根、枝、叶入药,是重要的中药材树种,具有较高的经济和生态价值。由于花榈木野生资源稀少且易遭破坏、零星分布于村寨边或自然保护区中,被列为国家二级保护树种。花榈木种子结实较差、大小年现象严重,且种子存在种皮坚硬、透水性差、不易吸水和优良性状不稳定等问题,使得播种繁殖受到限制。因而寻求花榈木优良苗木的繁育方法是解决种子来源不足和培育高质量苗木的基础。体细胞胚胎发生较器官发生是一种更加高效的无性繁殖方法,能够通过生物反应器进行规模化繁育。它是植物细胞具有较高可塑性和细胞全能性的体现,并且对无性繁殖、种质资源保存和遗传转化等具有重要意义。为了建立花榈木体细胞胚胎发生体系及探索其发生机理,本文对影响花榈木体胚发生诱导的内外因子进行筛选,并对花榈木不同体胚时期的生理生化特性、组织细胞学变化、组织化学特性和分子生物学特性展开研究,以期建立花榈木体胚发生体系,并从生理生化、组织细胞学和组织化学以及转录组学等方面揭示花榈木体细胞胚胎发生机理,并初步探索人工种子制作方法。主要研究结果如下:1.花榈木体细胞胚胎发生受外部因子和内部因子共同影响。在外部因子中,成熟胚在B5培养基中添加BA(0.2 mg/L)和2,4-D(2.75 mg/L)或BA(1.0 mg/L)和NAA(0.5 mg/L)效果最好,胚性愈伤组织诱导率均超过30%。胚性愈伤组织的增殖诱导率在B5培养基中添加KT(0.5 mg/L)和2,4-D(1.0 mg/L)的诱导率较高,质地较好。培养方式以悬浮培养胚性愈伤组织增殖率和体胚发生频率高。培养基中添加30g/L蔗糖和0.5 g/L谷氨酰胺能够促进胚性愈伤组织和体细胞胚胎的诱导。在内部因子中,基因型GZGL的胚性愈伤诱导率最高(41.07%),基因型GZPT体胚诱导率最高(18.4%);在不同外植体中,成熟胚是花榈木体细胞胚胎发生适宜的外植体;而未成熟胚的体胚诱导率以9月初采集的材料最好。2.体细胞胚的萌发率在B5培养基中添加BA(0.5 mg/L)和NAA(0.2 mg/L),其萌发率最高为54.81%;子叶胚数量在B5培养基中添加TDZ(0.5 mg/L)和NAA(0.2 mg/L)较多;而子叶胚的生根诱导率在B5培养基中添加0.5 mg/L IBA和0.5 mg/L NAA,其生根率最高为92.5%;健壮的幼苗在瓶内驯化一周后,移栽至基质(珍珠岩:蛭石:泥炭土=1:1:1)中成活率可达97.2%。人工种子胶囊的物理性质受制作方法和附加物的影响。在人工种子制作方法中,双层包埋法的人工种子胶囊物理性质优于单层包埋法,且其外观形状较空心珠法更加完整。双层包埋法人工种子胶囊添加20g/L保水剂,其物理性质最好。花榈木人工种子胶囊添加B5培养基、1.0 mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA、1.0 mg/L GA_3、30 g/L蔗糖,其萌发率为96%,但人工种子萌发率在4℃下随贮藏时间的增加呈逐渐下降趋势。3.对花榈木体细胞胚胎发生的细胞组织学和扫描电镜观察发现,花榈木成熟胚经脱分化形成胚性愈伤组织,胚性愈伤组织发育形成球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚,其发育过程类似于合子胚。与EC相比,异常愈伤组织呈现出不同的细胞结构和表面结构,如NEC细胞组织较大和细胞表面呈褶皱状、BC细胞组织存在破裂现象,SC细胞外侧包被着一层纤细长的组织;这些细胞组织结构的特征是异常愈伤组织在细胞学上解释其不能进一步形成体胚的原因。组织化学观察发现随着体胚的发育(EC-GE-CE),淀粉粒染色逐渐变浅,而蛋白粒染色逐渐变深;与EC相比,SC的淀粉粒和蛋白粒染色较深,而NEC、BC较浅。4.对花榈木不同体胚时期的生理生化特性研究表明,随着体胚发育(EC-GE-CE),可溶性糖、淀粉含量,PPO、SOD、APX、POD活性和IAA/ABA、IAA/GAs、AUX/GAs、AUX/ABA比值呈降低的趋势;相反,可溶性蛋白、H_2O_2和各类内源激素含量整体呈升高的趋势;而CAT活性、IAA/CKs、AUX/CKs、ABA/CKs和GAs/CKs比值呈先升高后降低的趋势。高的GAs、ABA含量、高的ABA/CKs、GAs/CKs比值,低的IAA/ABA、IAA/GAs、AUX/GAs、AUX/ABA比值是愈伤组织不能形成EC的原因。低的能量物质、H_2O_2含量和低的酶活性与NEC的形成有关;高的可溶性糖、H_2O_2、AUX、CKs含量、高的PPO活性和低的可溶性蛋白含量是愈伤组织形成BC的根本原因;高的能量物质含量、低的SOD、POD活性易形成SC。5.花榈木体胚发生四个时期RNA-seq的差异基因共计38100个,NEC vs EC,EC vs GE和GE vs CE的差异基因数量分别为11589,8999和27982。其中,植物激素信号转导途径在体胚发生不同阶段均被显著富集。参与植物激素信号转导AUX/IAA、ARF、CRE1、GID1、DELLA、PYL基因以及植物激素合成KAO、GA3OX、ABA2、AAO3基因下调促进胚性愈伤组织的形成;而AUX/IAA、ARF、CRE1、B-ARR、GID1、DELLA、PYL、ABF基因以及植物激素合成CPS、KAO、GA20OX、GA3OX、VED基因的上调促进体胚的成熟分化。


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