杜仲EuDIR1过表达对番茄抗真菌病害影响研究

【摘要】：番茄(Solanum Lycopersicum Mill.)为一年或多年生草本植物,是全世界栽培地区较广且最易染病的蔬菜作物之一。DIRs蛋白参与木脂素和木质素的生物合成。有研究证明,杜仲EuDIR1蛋白能抑制污黑腐皮壳菌和尖孢镰刀菌生长。另外,致病疫霉、H_2O_2和NO的侵染,均可诱导马铃薯St DIR1基因不同程度的上调表达。“外源基因清除”技术(Gene-Deletor)利用器官特异或诱导型启动子、重组酶及融合识别位点构建基因表达元件,试图将转基因植物中的全部外源基因在完成其功能后自动地从花粉、种子以及果实中清除。为了获得抗病番茄植株和不含外源基因的番茄果实,本研究利用基因工程技术,构建了含Gene-Deletor系统的杜仲EuDIR1基因植物表达载体,对Micro-Tom番茄进行遗传转化,研究EuDIR1表达对转基因番茄植株表型、灰霉病白粉病及尖孢镰刀菌抗性和木质素含量的影响,并统计果实中外源基因的删除率。取得的结果如下:1.EuDIR1基因对番茄的遗传转化及相对表达量分析利用本实验室前期载体p GM626-Act1,构建果实特异性E8启动子启动FLP基因的Gene-Deletor系统,以Bar基因作为筛选基因,GUS基因作为报告基因,Act1驱动杜仲EuDIR1基因的植物表达载体,进行农杆菌介导番茄遗传转化,经除草剂basta抗性筛选,以GUS组织化学染色和目的片段的PCR扩增验证,最终获得30株转基因番茄植株。取转基因番茄植株进行荧光定量PCR,结果发现在转基因番茄株系TP9中EuDIR1基因的相对表达量最低,是转空载体植株EV的1.16倍,株系TP1中相对表达量最高,是EV的3.52倍;株系TP2、TP4、TP5和TP12中的EuDIR1基因相对表达量也较高,分别为EV的2.36倍、3.23倍、2.24倍和2.18倍。说明EuDIR1基因已整合到番茄基因组中并正常转录,可进行后续实验。2.EuDIR1基因表达对番茄表型影响对移栽30d后的野生型、转空载体和13株转EuDIR1基因番茄植株进行表型观察,测量番茄植株株高、基径以及从下至上数第5片叶叶长和叶宽。结果发现,转基因番茄表型与野生型、转空载体番茄相比差异不显著。说明EuDIR1基因表达对番茄株高、叶片大小及数量等表型无显著影响。3.EuDIR1基因表达对番茄灰霉病、白粉病以及尖孢镰刀菌的抗性影响采用离体叶片接种法,接种灰霉病病菌。接菌7d后,野生型的番茄、转空载体番茄叶片上灰霉病斑已经大面积扩散到其它未接菌小叶上,转基因番茄病斑只是小面积扩散到小叶。对接菌7d后叶片上病斑直径进行统计分析,发现野生型、转空载体番茄叶片上病斑平均直径分别是2.415±0.13cm和2.496±0.08cm,而转基因番茄叶片上病斑平均直径仅为1.539±0.10cm,比野生型低36.3%,比转空载体低38.3%,且差异都达到极显著水平(P0.01)。表明杜仲EuDIR1基因表达提高了番茄对灰霉病抗性。同样采用离体叶片接种法,接种白粉病病菌。接菌7d后野生型番茄、转空载体番茄叶片上白粉病病斑明显增大,未接菌的小叶上出现病斑,转基因番茄叶片上白粉病病斑较小,且未接菌的小叶上未出现病斑。对接菌7d后叶片上的病斑直径进行统计分析,发现野生型、转空载体番茄叶片上病斑平均直径分别是1.819±0.11cm和1.777±0.07cm,转基因番茄叶片病斑平均直径为1.314±0.06cm,比野生型低27.8%,比转空载体低26.1%,差异均达到极显著水平(P0.01)。表明杜仲EuDIR1基因的表达提高了番茄对白粉病的抗性。采用小米粒接种法,对番茄进行尖孢镰刀菌接种。发现野生型和转空载体番茄平均株高分别是6.93±0.55cm和6.72±0.41cm,平均根长分别是6.09±0.59cm和6.29±0.46cm,转基因番茄的平均株高7.38±0.49cm,比对照提高了6.5%和9.8%,差异达到显著水平(0.01P0.05);转基因番茄的平均根长6.86±0.48cm,比对照提高了12.6%和9.1%,差异达到显著水平(0.01P0.05);野生型和转空载体番茄平均地上生物量分别是129±6mg和131±4mg,地下生物量分别是6.74±0.7mg和6.51±0.9mg,转基因番茄的平均地上生物量为142±4mg,比对照提高10.1%和8.4%,差异达到显著水平(0.01P0.05);转基因番茄平均地下生物量为7.81±0.5g,比对照提高15.9%和19.9%,差异达到极显著水平(P0.01)。说明在尖孢镰刀菌的胁迫下,转基因番茄发病的程度低于转空载体和野生型番茄,即EuDIR1基因的表达增强了番茄对尖孢镰刀菌的抗性。4.EuDIR1基因表达对番茄木质素含量的影响将转基因番茄、转空载体和野生型番茄叶片和茎段进行木质素含量的测定,结果发现野生型与转空载体番茄叶片中木质素含量平均值分别是1.87±0.06和1.76±0.05(OD280/g,FW),转基因番茄叶中木质素含量为2.09±0.11(OD280/g,FW),比对照提高11.7%和18.8%,差异达到显著水平(0.01P0.05);野生型与转空载体番茄茎中木质素含量是2.31±0.06和2.25±0.04(OD280/g,FW),转基因番茄茎中含量为2.63±0.13(OD280/g,FW),分别比对照提高13.9%和16.9%,差异达到显著水平(0.01P0.05)。说明杜仲EuDIR1基因的表达提高了番茄木质素含量。5.转EuDIR1基因对番茄细胞壁发育的影响扫描电镜观察发现,转基因叶片木质部导管附近细胞的细胞壁,较转空载体细胞壁更厚。说明EuDIR1基因表达提高了番茄木质部细胞的细胞壁厚度。6.转EuDIR1基因番茄果实外源基因删除效率利用目的基因EuDIR1和GUS基因设计引物对转基因和转空载体番茄果实进行PCR验证,结果发现30株转基因番茄果实中有11株果实外源基因被删除,删除率为36.67%,30株转空载体番茄果实中有13株果实外源基因被删除,删除率为43.33%,两者差异达到极显著水平(P0.01)。