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转拟南芥FAD8基因油菜脂肪酸代谢及抗寒性的研究

沈奇  
【摘要】: 油菜是重要的油料经济作物,利用基因工程手段调控其脂肪酸代谢途径,改善油脂膳食营养,提高植株抗逆性是目前油料作物改良的重点。拟南芥脂肪酸脱饱和酶FAD8基因编码叶绿体ω—3脂肪酸脱饱和酶,该酶在低温下催化二烯酸迅速脱饱和产生三烯酸,该酶可显著提高植物中不饱和脂肪酸含量,增强种子油脂营养价值及植株对低温的适应力。本研究建立了油菜高效转化体系,利用本实验室克隆的拟南芥FAD8基因构建正义和反义表达载体遗传转化油菜。筛选转基因植株研究了FAD8基因脂肪酸代谢和抗寒性的影响,获得较好的结果。 1、以甘蓝型油菜特选4号下胚轴及子叶为转化受体材料,研究基因型、苗龄、激素组合及浓度、取材时间、培养时间、外源基因等因素对其转化效率的影响,确定最适的分化培养基为:MS+6-3mg/L BA+0.1mg几NAA。在添加0.1mg/L2,4-D的MS培养基中预培养3d,重悬5倍的菌液中浸染转化(下胚轴30s;及子叶5min),转化后再经2d共培养、6d脱菌培养后进行筛选培养转化效率较高。 2、采用农杆菌介导法将FAD8基因(载体为pSH-FAD8、Psh-anti-FAD8)遗传转化油菜下胚轴、子叶、子叶柄等外植体,并获得转基因植株。经徒手切片GUS染色检验出阳性植株,再经PCR及RT-PCR鉴定,进一步检测出7株转化正义FAD8基因植株,9株转化反义FAD8基因植株。 3、提取油菜脂肪酸进行反相薄层层析及气相色谱分析,结果表明转化反义FAD8基因叶片中亚麻酸降低,油酸及亚油酸均有不同程度提高,转化正义FAD8基因叶片中仅有1株亚麻酸提高。转化正义及反义FAD8基因F1代种子均获得60%以上的高油酸含量,可做为油菜品种改良的新材料。 4、叶片离体抗寒实验结果表明,转基因植株抗寒性明显高于对照。筛选出两个抗寒能力最强的转基因油菜单株,其F_1代植株进行抗寒性鉴定:叶绿素含量、超氧化物岐化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、丙二醛含量、脯氨酸含量等均反映出转化FAD8基因植株的抗寒性显著增强。 5、转基因植株在田间可正常生长并开花结实,但转FAD8植株现蕾及抽薹期比对照推迟70d,转anti-FAD8植株比对照推迟40d。转基因植株叶型、叶片组织、株高、株型均有改变,部分薹茎自然扭曲。转基因植株还出现雄性不育的性状。


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