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根癌农杆菌拮抗真菌的筛选、发酵及有机锡新化合物抗TMV、抗癌机制研究

李祝  
【摘要】: 由致病性根癌农杆菌和植物病毒引起的植物病害分布于世界各地,给农业生产造成严重经济损失,引起世界各国的高度重视。根癌农杆菌(Agrobacterium tumfaciens)通过侵染植物的根茎部形成冠瘿瘤,使感病植株生长迟缓,树势弱,产量少,寿命短,直接影响了果树产品的生产,从而影响了农业经济的发展。烟草受烟草花叶病毒(TMV)侵染后,其代谢受到严重影响,光合速率下降,叶片会不均匀地褪绿、枯黄,使植株生长矮小,干物质积累减少,损害烟叶质量,是我国目前最主要的农业病害之一。 本文分为两个部分。第一部分是针对目前根癌病的生防细菌不耐旱,寿命短的缺点,首次从果树根系土壤中筛选拮抗根癌农杆菌的生防真菌,并确定生防真菌的发酵条件,为植物根癌病生防菌株的开发及应用扩大菌种资源;另一部分是针对目前防止TMV的一般药剂很难在不伤害寄主的情况下抑制病毒增殖,首次对南开大学李正名院士提供的有机锡新化合物04-W0319进行了抗TMV活性及机制的研究,并在此基础上对04-W0319的抗肿瘤机制进行了系统研究,为开发低毒、高效的有机锡新化合物,拓展其应用范围提供参考依据。 在第一部分的研究中,从我国12个省市采集的土样中分离纯化出152株真菌,采用琼脂柱初筛,得到2株抗根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens T-37(简称T-37)的真菌菌株,通过滤纸片法进行对比复筛,证实了此2株菌株对根癌农杆菌具有拮抗作用。根据Raper(1965)关于曲霉属的分类标准,拮抗1号真菌菌株的主要形态特征与他所描述的黑曲霉(Aspergillus niger V.Tieghen 1867)的标准形态基本相同,鉴定该菌株属于曲霉属黑曲霉群的一株黑曲霉,记为黑曲霉xj(Aspergillus niger xj),并将该菌种保藏在中国典型培养物保藏中心。根据Brown Smith(1957)的分类标准,拮抗2号菌株鉴定为轮枝拟青霉,记为轮枝拟青霉49-01(Paecilomyces verticillatus 49-01),为新种。 对xi菌株进行单孢子分离,获得8个单孢子株,分别记为xj-1、xj-2、xj-3、xj-4、xj-5、xj-6、xj-7、xj-8。通过对菌落生长情况、产孢量、分生孢子的萌发率、对T-37抑制活性的综合比较,认为xj-5为优势单孢子株,并对其继代培养后的培养性状及对T-37的抑制活性进行了考察,xj-5单孢子株所表现出的遗传性状较为稳定并且所产生的抑菌圈直径(20.13±0.09 mm)高于对照xj菌株(18.28±0.21 mm)。以xj-5单孢子株作为出发菌株,对其发酵工艺条件进行探索。 对培养成分中2%的麦芽糖、葡萄糖、淀粉、蔗糖、乳糖、甘油6种碳源和3%的蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、硝酸铵、氯化铵、脲素6种氮源进行单因素筛选,选择麦芽糖、蔗糖为碳源,酵母膏、蛋白胨为氮源,并设计L_9(3~4)正交实验对C/N进行优化。确定xj-5菌株的发酵培养基组成为:麦芽糖2%,蔗糖2%,酵母膏3%,蛋白胨1%。 对培养条件中的不同接种量、装液量、培养温度及发酵培养基起始pH值分别进行了筛选。确定xj-5菌株的发酵培养条件为:接种15%、摇瓶装液量10%、培养温度25℃、发酵培养基起始pH自然。 根据以上筛选出的培养基成分和培养条件,将xj-5菌株接种摇瓶培养,每隔24h定时取样,测定生物量和抑菌圈直径,绘制发酵动态曲线。结果显示:xj-5菌株直接进入对数生长期,无生长延迟期,这可能是因为加入的液体母种活力强,并且培养条件的差异不大,菌株能很快适应发酵环境,直接进入快速生长期,并且这段时间较长(1-8d),生物量在第8天的时候达到了最大(161.24g/L),同时抑菌成分也在不断分泌与积累。随后延迟期(9-12d)持续了较长的时间,并在当在第10天的时候,代谢产物的累积达到了高峰,抑菌圈直径达到最大(54.48 mm)。随着发酵培养基营养的耗尽,衰老期的出现(13-15d),毒素的累积及菌体自溶导致生物量急剧下降,而细胞内容物的流出和细胞碎片的产生导致发酵培养基pH值的变化,直接影响着xj菌株的抑菌成分的活性,以致抑菌圈直径也急剧下降。 因此,根据xj-5菌株的发酵动力学的模型,确立xj-5菌株抑菌活性成分的发酵工艺为:制备麦芽糖2%,蔗糖2%,酵母膏3%,蛋白胨1%,pH自然的发酵培养基,将xj-5菌株按15%的接种量,接种到装液量为10%的液体发酵培养基中,25℃,120rpm,摇瓶培养10d,收集菌丝体制备发酵浓缩液,滤纸片法测xj-5菌株的抑菌圈直径达54.48 mm。 第二部分的研究以心叶烟为材料,得到有机锡新化合物04-W0319对烟草花叶病毒侵染的治疗效果为49.38%;钝化效果为73.23%;保护效果为48.82%。 500μg/mL 04-W0319与TMV体外作用30min,电镜下观察,显示病毒粒体出现断裂现象,粒体结构受到了破坏;琼脂糖凝胶电泳显示04-W0319对TMV-RNA具有体外降解作用;TMV-CP的UV测定结果反映了04-W0319对烟草花叶病毒的体外聚合过程具有抑制作用。 对普通烟K326的PAL、POD和SOD的活性进行了测定。PAL活性测定结果表明:500μg/mL 04-W0319处理的烟苗在第7天达到酶活高峰值,第9天降到最低,并且烟草在接种TMV后再用04-W0319处理可使酶活性增加。POD活性测定结果表明:单独用04-W0319处理的酶活在第7天达到酶活高峰值,烟草在接种TMV后再用04-W0319处理也可使酶活性增加,在第9天达到酶活高峰值,并高于其它处理。SOD活性测定结果表明:TMV处理的酶活于第5天达到一个高峰值,随后酶活在第9天又达到另一个高峰值,接种TMV后再用04-W0319处理的与发病对照的酶活趋势一致,单独用04-W0319处理的烟苗酶活在第5天达到高峰值,并高于其它处理组。 K326的胞间蛋白经SDS-PAGE不连续电泳分析表明:化合物04-W0319对K326的胞间蛋白影响不大,并且对PR蛋白的诱导也不强。 04-W0319对寄主叶绿素含量的影响实验结果显示:TMV感染后使得烟草叶片中叶绿素的含量大大降低,04-W0319处理的烟草叶片叶绿素含量有所提高,说明04-W0319能够减少病毒对烟草叶片中叶绿体的破坏作用,增加了叶绿素的含量,从而提高寄主的抗病性;但药剂处理烟草叶片的叶绿素含量仍然低于健康对照,这也说明04-W0319不能完全抑制病毒对叶绿素的破坏作用。 因此,04-W0319一方面可在体外与TMV作用,降低TMV的侵染率;另一方面可提高寄主防御酶系活性和增加叶绿素含量,提高寄主抗性,抵御TMV的侵染。 以PC3、Bcap-37和BGC823肿瘤细胞为材料,04-W0319作用72h对PC3细胞的IC_(50)为0.13μg/mL;作用48h对Bcap-37细胞的IC_(50)为0.18μg/mL;作用48h对BGC823细胞的IC_(50)为0.17μg/mL。细胞毒性实验初步判断:04-W0319诱导3株细胞死亡主要不是通过细胞毒性。 划痕标记法实验表明04-W0319可降低3株细胞的运动能力而抑制肿瘤细胞的生长。细胞形态学观察及细胞培养液上清中LDH活力测定表明:72h内凋亡始终是04-W0319诱导PC3和Bcap-37细胞死亡采用的主要方式;48 h内凋亡始终是04-W0319诱导BGC823细胞死亡采用的主要方式。流式细胞分析术检测结果进一步揭示:0.15μg/mL 04-W0319作用48h,将PC3或Bcap-37细胞阻滞在G_2/M期而抑制细胞的生长、繁殖;当作用时间延长或作用浓度增高时,以诱导细胞发生凋亡为主;对BGC823细胞,0.15μg/mL 04-W0319作用48h,将细胞阻滞在G_0/G_1期,并伴随诱导凋亡而抑制细胞的生长、繁殖;但随着作用时间的延长,04-W0319将BGC823细胞周期阻断在G_2╱M期,并伴随着细胞发生坏死。 免疫印迹(Western Blot,WB)实验结果显示:04-W0319可激发PC3、Bcap-37细胞p21蛋白的表达,从而阻碍了细胞通过细胞周期G_2╱M期的限制点,抑制细胞的生长。而对BGC823细胞,04-W0319通过抑制CyclinD蛋白的表达,阻碍了细胞通过细胞周期G_0/G_1期的限制点,抑制细胞的生长。总的来说,04-W0319对3株细胞中的CDK_2和CDK_4都没有影响,提示04-W0319的作用靶标相对专一。


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