DKD大鼠肾组织中GSK-3β对GSK-Wnt通路与RANKL-NF-κB通路交互作用相关因子调控机制研究

【摘要】：目的:研究DKD大鼠肾组织中GSK-3β对Wnt/β-catenin信号通路与NF-κB信号通路的相关因子OPG、RANKL、OPN及SM22等的调控作用及上述通路的交互作用,并比较应用Li CL与Ar-a014418两种GSK-3β抑制剂的作用差异。方法:选取健康8周龄SD实验大鼠40只,适应性喂养2w后,随机选择10只为正常对照组(NC组,n=10);其余30只通过腹腔注射链脲霉素(STZ)先建立大鼠糖尿病(Diabetes mellitus,DM)模型。予NC组大鼠腹腔注射相同体积的溶剂。DM大鼠成模10w后,检测大鼠血糖及24h尿微量白蛋白。若连续三次测血糖均高于16.7mmol/L,24h尿微量白蛋白定量≥30mg/L,或者超过正常组大鼠的10倍,则证实大鼠DKD模型成功。在DKD成模大鼠中随机选择10只为DKD模型组(DKD组,n=10);随机选择10只为非ATP竞争性GSK-3β抑制剂氯化锂(lithium chloride,Li Cl)干预组(Li Cl组,n=10)按15mg/kg剂量行腹腔注射Li Cl(隔天1次,连续10天);其余10只为ATP竞争性GSK-3β抑制剂Ar-a014418干预组(ARA组,n=10)按1mg/kg剂量行腹腔注射Ar-a014418(隔2天1次,连续10天);其余组给予等体积药物溶剂注射。分阶段检测血糖、24h尿微量白蛋白。末次腹腔注射结束3d后处死大鼠,留取肾脏组织,分别进行以下实验:行苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE)方法观察肾组织病理改变;应用免疫组化(immunohistochemistry,IHC)En Vision二步法检测GSK-3β、NF-κBp65、OPN、OPG、RANKL、β-catenin、SM22在肾组织中的表达;采用实时定量-聚合酶链反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR)方法检测OPN、OPG、RANKL、β-catenin的m RNA在肾组织中的表达水平;应用免疫印迹(Western blot,WB)方法检测p GSK-3β(ser9),β-catenin,NF-κBp65 and OPN蛋白在肾组织中的表达。结果:1、成功复制大鼠DKD模型并行药物干预:两种GSK-3β抑制剂组的一般状态和生存率均较DKD组好,生存率(95%)明显大于DKD组生存率(90%)。2、与NC组相比,DKD、Li Cl组及ARA组血糖、24h尿微量白蛋白均明显升高;与DKD组相比,Li Cl组与ARA组血糖、24h尿微量白蛋白降低(均P0.05)。3、光镜显示:DKD组大鼠肾组织可见肾小球肥大,肾小管上皮细胞水肿明显,管腔狭窄、闭塞,炎性细胞浸润等DKD早期病理改变;Li Cl组与ARA组大鼠肾组织上述病理改变均在一定程度上减轻。4、IHC显示:(1)与NC组相比,DKD组GSK-3β表达明显增强,与DKD组相比,Li Cl组与ARA组GSK-3β的表达显著减弱(均P0.05)。(2)与NC组相比,DKD组与两种GSK-3β抑制剂组均有NF-κBp65增多并核移位,其下游因子OPN的表达随之上升;但与DKD组相比,Li Cl组与ARA组NF-κB p65及OPN的表达减少,且NF-κB p65核移位减少(均P0.05)。(3)与NC组相比,DKD组NF-κB上游因子OPG及RANKL表达均有增强,但OPG/RANKL比值减小;与DKD组相比,Li Cl组与ARA组RANKL的表达减弱,OPG/RANKL比值增大(均P0.05)。(4)与NC组相比,DKD组与两种GSK-3β抑制剂组β-catenin表达及核移位均有增强,但ARA组较Li Cl组与DKD组有更显著差异(均P0.05)。(5)DKD组肾小管部分上皮细胞SM22表达弱阳性,Li Cl组与NC组无显著差异,ARA干预组SM22表达较其他3组显著增强。5、RT-q PCR显示:(1)与NC组相比,DKD组OPN m RNA表达均有增强;但与DKD组相比,Li Cl组与ARA组OPN m RNA表达减弱(均P0.05)。(2)与NC组相比,DKD组OPG与RANKL m RNA表达均有增强,但OPG m RNA/RANKL m RNA比值减小;与DKD组相比,Li Cl组与ARA组OPG及RANKL的表达减弱,但OPG m RNA/RANKL m RNA比值增大(P0.05)。(3)与NC组相比,DKD组与两种GSK-3β抑制剂组β-catenin m RNA表达均有增强,但ARA组较Li Cl组与DKD组有更显著差异(均P0.05)。6、Western blot显示:(1)与NC组相比,DKD组p GSK-3β(ser9)表达减弱,与NC组及DKD组相比,两种GSK-3β抑制剂组p GSK-3β(ser9)表达均有显著增强(P0.05)。(2)与NC组相比,DKD组NF-κBp65增多,其下游因子OPN的表达随之上升;与DKD组相比,Li Cl组与ARA组NF-κB p65及OPN表达减少(均P0.05)。(3)与NC组相比,两种GSK-3β抑制剂组β-catenin表达增强,但ARA组较Li Cl组与DKD组有更显著差异(均P0.05)。结论:GSK-3β在DKD大鼠肾组织中至少部分地通过GSK-Wnt信号通路与RANKL-NF-κB信号通路的交互作用正性调控NF-κB信号通路的活性:1.高血糖引发的DKD大鼠肾组织中活性GSK-3β增多,可上调RANKL、NF-κB、OPN等炎症损伤关键基因,引起肾脏早期病理改变,导致24h尿微量白蛋白量上升,促发并加重糖尿病肾脏损伤。2.使用GSK-3β抑制剂可通过磷酸化GSK-3β而使之失活,引起β-catenin通路激活,下调RANKL、NF-κB、OPN等炎症损伤关键基因,改善DKD大鼠的一般状态及肾脏早期病理改变,并降低DKD大鼠的血糖、24h尿微量白蛋白,在一定程度上能延缓DKD进程;然而,两种GSK-3β抑制剂在DKD大鼠肾组织中对β-catenin和SM22的作用有明显的差异:Ar-a014418的作用远超较Li Cl,可引起的β-catenin浓度急剧上升,可致Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因SM22异常表达。