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基于NF-κB信号通路rNS1/2对甲型流感病毒诱导小鼠β防御素4产生的作用及其机制研究

牟秋菊  
【摘要】:目的运用基因工程方法获得重组甲型流感病毒H1N1非结构蛋白1(r NS1)和2(r NS2),探讨r NS1和r NS2对小鼠呼吸道组织β防御素4产生的作用,以及其β防御素4基于NF-κB信号通路的作用机制。方法1、运用RT-PCR方法从甲型流感病毒株A/PR/8/34(H1N1)扩增NS1、NS2基因,构建原核表达质粒p ET22b(+)/NS1,p ET22b(+)/NS2,经酶切、PCR和基因测序鉴定正确后,转化大肠杆菌Rosetta-gami(2),用IPTG诱导表达,经亲和层析、超滤获得重组蛋白,通过SDS-PAGE电泳和Western Blot分析鉴定重组蛋白的正确性;2、将BALB/c小鼠随机分为r NS1组(100μg/kg)、r NS1+病毒RNA组;r NS1+病毒组、RNA组(50μg/kg)、病毒组(0.2×LD50)、正常对照组、r NS2+病毒组、r NS2+病毒RNA组、r NS2组(100μg/kg),共9组,每组6只,每组随机给3只小鼠提前12h腹腔注射PDTC(50mg/kg),再将相应制剂通过滴鼻给予小鼠,24h后采用RT-PCR、HE染色、western blot、免疫组化等方法检测各组小鼠气管和肺组织的Mbd4、IFN-γ、IκB、磷酸化IκB、P50、P65等各项指标的基因和蛋白表达情况。结果1、经限制性内切酶酶切鉴定,构建的NS1重组质粒和NS2重组质粒于约2000bp、1500bp大小处可见条带;RCR鉴定,可见两个重组质粒分别于693bp、366bp大小处的条带;序列测定和比对,可知p ET22b(+)/NS1、p ET22b(+)/NS2原核表达质粒插入序列无突变,阅读框架正确;2、SDS-PAGE电泳检测可见建立的NS1、NS2重组蛋白的表达系统Rosetta-gami(2)-p ET22b(+)/NS1和Rosetta-gami(2)-p ET22b(+)/NS2经IPTG诱导可见在23KD和12KD左右处明显的目的蛋白条带;Western Blot检测显示两个重组目的蛋白可分别于IAV NS1和IAV NS2的特异性抗体杂交,在相应位置出现单一条带;3、通过纯化去盐使r NS1和r NS2蛋白得以纯化,经SDS-PAGE电泳可见较单一的目的蛋白r NS1和r NS2;4、r NS1或r NS2滴鼻给予小鼠后12小时,经组织切片HE染色后观察可见小鼠气管和肺组织出现大量炎性浸润细胞,气管管壁增厚;5、RT-PCR、免疫组化和Western blot结果表明甲型流感病毒可诱导机体IFN-γ和MBD4产生,r NS1和r NS2的介入可抑制病毒的诱导作用,阻断NF-κB信号通路后MBD4的表达明显减少。结论1、建立了甲型流感病毒H1N1的NS1和NS2蛋白的原核表达系统,成功获得重组NS1和NS2蛋白;2、甲型流感病毒可以通过激活NF-κB信号通路诱导小鼠呼吸道组织产生β防御素4;3、通过动物实验证实重组甲型流感病毒NS1和NS2具有抑制流感病毒诱导小鼠呼吸道组织β防御素4的产生,该抑制作用与NF-κB信号通路有关。


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