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埃及伊蚊yellow基因家族表达谱分析及rAa-Yc蛋白的功能初探

颜凤  
【摘要】:目的:筛选并鉴定埃及伊蚊(Aedes aegypti)全基因组中yellow基因,分析其基因结构、基因进化以及在不同发育时期和不同组织的表达谱。并针对Aa-Yc作为研究对象,通过重组表达以获取rAa-Yc活性蛋白,并对其可能的功能进行初步探索,为进一步探讨其在病原与蚊虫宿主的相互作用奠定基础。方法:运用模式昆虫黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)Dm-yellow基因(GenBank No.AAF45497)的王浆主蛋白(Major royal jelly protein,MRJP)结构域氨基酸序列,在埃及伊蚊全基因组数据库中筛选并鉴定埃及伊蚊yellow基因家族,采用瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统(ExPASy)在线相关工具包分析其理化性质和结构域,运用SignalP4.1预测信号肽,结合使用DNAstar、MEGA6.0和GeneDoc软件包进行同源性比对、保守性分析及进化树构建。提取埃及伊蚊总RNA,合成cDNA,利用荧光实时定量PCR(qRT-PCR)法对埃及伊蚊不同发育时期(卵、Ⅰ~Ⅳ龄幼虫、蛹以及未吸血雌蚊和雄蚊)和未吸血雌蚊不同组织(唾液腺、中肠、脂肪体和卵巢)的表达谱进行相对定量分析,并构建Aa-Yc基因在埃及伊蚊吸血后唾液腺中的阶段性表达谱(饱血0时、饱血24 h)。从Vecterbase上埃及伊蚊基因组数据库中获取埃及伊蚊唾液腺黄蛋白Aa-yellow-c(Aa-Yc)(GenBank No.EAT40936)的全长序列,利用ExPASy中有关基因和蛋白序列的分析工具,分析预测该蛋白质的结构功能;设计基因特异性引物采用RT-PCR技术从埃及伊蚊(广东电白株)雌蚊体内扩增Aa-Yc基因成熟肽序列,并将其克隆到原核表达质粒pEasy-E1和真核表达质粒pMT/Bip/V5-HisA。原核表达重组质粒pEasy-E1-Aa-Yc在大肠杆菌Rosetta(DE3)中经用异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹(western blotting)鉴定。镍柱纯化后的r Aa-Yc经皮下注射免疫新西兰大白兔制备重组抗体,采用间接酶联免疫吸附法(ELISA)检测抗体效价。真核表达重组质粒pMT/Bip/V5-Aa-Yc和筛选载体pCoHygro经电穿孔共转染入果蝇S2细胞,经潮霉素B压力筛选建立稳定表达Aa-Yc的S2细胞系。采用手工法检测raa-yc对人全血部分凝血酶原时间(prothrombintime,pt),凝血酶时间(thrombintime,tt)及凝血活酶时间(activatedpartialthromboplastintime,aptt)的影响;血小板聚集仪检测raa-yc对二磷酸腺苷(denosinediphosphate,adp)诱导的人血小板聚集功能的影响。结果:从埃及伊蚊全基因组中筛选出12条yellow基因(aa-yellow、aa-yellow-b、aa-yellow-c、aa-yellow-d、aa-yellow-e、aa-yellow-f2、aa-yellow-fb、aa-yellow-fc、aa-yellow-g、aa-yellow-g2、aa-yellow-h和aa-yellow-x)。生物信息学分析结果显示,12条yellow基因均具有mrjp结构域和信号肽序列。同源性比对结果显示,埃及伊蚊yellow基因家族成员间相似性较低,为15%~49%;但其保守域间同源性较高,可达60%。系统进化树分析结果显示,12个yellow蛋白分为5个亚家族,其中11个在黑腹果蝇中均有直系同源蛋白存在。qrt-pcr结果显示,aa-yellow-d和aa-yellow-x在雄蚊中高表达(p0.01或p0.05);aa-yellow-fc在雌蚊和唾液腺中特异高表达(p0.01);aa-yellow-f2在2龄幼虫中特异高表达(p0.01);aa-yellow、aa-yellow-e和aa-yellow-fb在3龄幼虫中特异高表达(p0.01);aa-yellow、aa-yellow-e、aa-yellow-f2、aa-yellow-fb、aa-yellow-h和aa-yellow-x等6条基因在卵巢中高表达(p0.01或p0.05);除aa-yellow-c和aa-yellow-x,其余基因几乎不在中肠表达;其中aa-yc(aa-yellow-c)在Ⅰ龄幼虫时期高表达,在不同组织中无统计学差异,在蚊虫吸血后的唾液腺中表达量显著上调。aa-yc序列全长1852bp,1~1287位为开放阅读框,n端含有一个由27个氨基酸组成的信号肽,生物信息学分析显示其具有mrjp结构域。rt-pcr扩增获得其成熟肽基因,将其克隆入peasy-e1载体,经pcr及dna测序证实peasy-e1-aa-yc重组质粒构建成功。测序结果显示,成熟肽基因长1200bp,编码399个氨基酸,等电点为4.67。将测序结果与原始序列比对显示获取的转录本第86位核苷酸由t(胸腺嘧啶)突变成c(胞嘧啶),导致第29个氨基酸由苯丙氨酸突变为丝氨酸。将已构建好的重组质粒转入大肠杆菌rosetta(de3)中经iptg诱导后获得包涵体表达。westernblotting证实获取的重组蛋白是目的蛋白。经elisa检测获取的高效价重组抗体。提取稳定转染aa-yc基因的s2细胞系基因组dna,经pcr鉴定并确定建立可稳定表达raa-yc的s2细胞系。raa-yc的抗凝血作用结果显示:raa-yc对pt、tt与aptt均无延时效应;血小板聚集抑制检测发现,raa-yc在0.0064-200ng/μl对adp诱导的血小板聚集均有抑制作用,但在0.16 ng/μl时抑制作用最强,但不呈量-效关系。结论:在埃及伊蚊基因组中获得的12条yellow基因同源性较低,且在不同发育时期和不同组织中表达有差异;埃及伊蚊吸血可调控Aa-Yc的表达;成功表达出原核rAa-Yc融合蛋白,并获取高效价(1:8000)兔抗rAa-Yc多克隆抗体,且该蛋白具有抑制血小板聚集功能;筛选到真核表达Aa-Yc的S2稳定细胞系。


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