精子P34H表达对精液内酶活性和精子受精能力的影响

【摘要】：目的:研究精子蛋白P34H表达对人精子顶体内顶体酶(arcosin)活性、透明质酸酶(hyaluronidase,HYD)活性和精浆中性α-糖苷酶(neutralα-glucosidase,NAG)活性及精子受精能力 的关系。通过构建慢病毒介导的能够稳定沉默小鼠附睾中P34H基因的干扰载体,观察其对小鼠精子中P34HmRNA、P34H蛋白的表达和小鼠精子P34H阳性率的抑制作用;并通过慢病毒介导的RNAi敲低P34H表达后分析对小鼠精子顶体内顶体酶活性、透明质酸酶活性和精子体外受精率的影响。方法:1.收集人精液标本共88例,将其分为20例正常生育组和68例不育组。按照世界卫生组织(WHO)颁布的标准对精液进行常规分析检测,根据精液参数的不同将不育标本分为正常精液参数不育组28例和精液参数异常不育组40例。通过实时荧光定量PCR法,测定P34HmRNA的表达量;Western blot测定P34H蛋白在人精子中的表达;免疫荧光用来观测P34H蛋白在人精子上的定位。2.运用改良明胶底物膜法检测精子顶体内arcosin活性(arcosin阳性反应率、arcosin活性强度);采用改良透明质酸钠-明胶底物膜法进行精子顶体内HYD活性的检测(HYD反应阳性率、HYD活性强度);采用精浆中性α-糖苷酶定量检测试剂盒(酶法)检测NAG活性;3.设计3条P34H的siRNA的靶点序列,合成含干扰序列的shRNA,分别与双酶切后的载体连接,构建 3 种重组质粒 GV-P34H-shRNA1、GV-P34H-shRNA2 和GV-P34H-shRNA3,并转化于细菌感受态细胞,提取阳性克隆并进行测序验证,分别将重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞。将3种重组慢病毒及阴性对照病毒分别注入小鼠附睾中,将10μl病毒液分别按正常对照组、GV-NC-shRNA 阴性感染组、GV-P34H-shRNA-1 感染组、GV-P34H-shRNA-2感染组及GV-P34H-shRNA-3感染组共5组注射。用Realtime-PCR和Western blot分别检测P34H mRNA和P34H蛋白的沉默效果,免疫荧光观察P34H蛋白在小鼠精子上的表达。4.按正常对照组、GV-NC-shRNA阴性感染组、GV-P34H-shRNA-l 感染组、GV-P34H-shRNA-2 感染组及 GV-P34H-shRNA-3 感染组5组,应用金霉素荧光染色法检测顶体反应率;采用改良明胶底物膜法检测顶体酶活性(顶体酶阳性反应率和顶体酶活性强度);改良透明质酸钠-明胶底物膜法对小鼠精子透明质酸酶(HYD)活性进行检测(HYD反应阳性率、HYD活性强度);与小鼠超排卵子进行体外受精实验检测受精率。结果:1.实时荧光定.量PCR检测结果显示:与正常生育组比较,不育各组(正常精液参数不育组和精液参数异常不育组)的P34H基因mRNA的相对表达量均明显低于正常生育组(P0.05);正常精液参数不育组的P34H基因mRNA相对表达量与精液参数异常不育组比较差异无统计学意义(P0.05)。Western blot检测:不育各组(正常精液参数不育组和精液参数异常不育组)精子P34H/β-actin平均光密度均明显低于正常生育组(P0.05);正常精液参数不育组与精液参数异常不育组比较差异无统计学意义(P0.05)。间接免疫荧光染色显示:不育各组(正常精液参数不育组和精液参数异常不育组)精子P34H阳性率均明显低于正常生育组(P0.05);正常精液参数不育组与精液参数异常不育组比较差异无统计学意义(P0.05)。精子P34H/β-actin平均光密度、精子P34H阳性率在NAG活性正常组与NAG活性异常组差异无统计学意义(P0.05)。2.不育各组(正常精液参数不育组和精液参数异常不育组)的arcosin活性(arcosin阳性反应率、arcosin活性强度)明显低于正常生育组(P0.05)。正常精液参数不育组和精液参数异常不育组的HYD活性(HYD阳性反应率、HYD活性强度)与正常生育组相比均有明显下降(P0.05)。相关性分析提示精子P34H蛋白表达量与arcosin活性(arcosin阳性反应率、arcosin活性强度)存在正相关性,相关系数(r=0.468,0.310;P0.01);精子P34H阳性率与arcosin活性(arcosin阳性反应率、arcosin活性强度)存在正相关性,相关系数(r=0.784,0.598;P0.01)。精子P34H蛋白表达量与HYD活性(HYD阳性反应率、HYD活性强度)存在正相关性,相关系数(r=0.449,0.431;P0.01);精子P34H阳性率与HYD活性(HYD阳性反应率、HYD活性强度)存在正相关性,相关系数(r=0.727,0.691;P0.01)。相关性分析提示精子P34H/β-actin平均光密度与精浆中性α-糖苷酶活性呈正相关性,相关系数(r=0.384,P0.01);精子P34H阳性率与精浆中性α-糖苷酶活性呈正相关性,相关系数(r=0.596,P0.01)。3.三种慢病毒干扰载体经测序证实均已构建成功,感染小鼠附睾后,P34H mRNA及P34H蛋白的表达均明显低于阴性感染组和正常对照组(P0.05);其中以 GV-P34H-shRNA1 作用显著,P34H-shRNA-1感染组的P34HmRNA表达较正常对照下调为76.2%,P34H蛋白表达较正常对照下调为65.8%,精子P34H阳性表达率降低至21.71%(P0.05);而差异在阴性组和正常对照组中无统计学意义(P0.05)。4.P34H-shRNA-1,2,3感染组的小鼠精子P34H阳性表达率、顶体反应发生率和顶体酶活性(顶体酶阳性反应率、顶体酶活性强度)均较阴性感染组和正常对照组明显降低(P0.05);P34H-shRNA-1,2,3感染组的小鼠精子透明质酸酶(HYD)活性(HYD阳性反应率、HYD活性强度)和体外受精率均较阴性感染组与正常对照组明显降低(P0.05),而差异在阴性感染组和正常对照组中无统计学显著性(P0.05);均以GV-P34H-shRNA 1作用最为显著。结论:1.精子蛋白P34HmRNA和蛋白表达在生育组和不育组中存在差异,不育患者精子P34HmRNA、P34H蛋白表达和精子P34H阳性率明显低于正常生育组。不育患者精子P34HmRNA、P34H蛋白表达减少和精子P34H阳性率降低的同时伴随arcosin活性(arcosin阳性反应率、arcosin活性强度)、HYD活性(HYD阳性反应率、HYD活性强度)和精浆中性α-糖苷酶活性减弱。2.精子P34H蛋白表达量和精子P34H阳性率分别与arcosin活性(arcosin阳性反应率、arcosin活性强度)、HYD活性(HYD反应阳性率、HYD活性强度)、精浆中性α-糖苷酶活性均存在正相关性。3.成功构建P34HshRNA慢病毒表达,可有效下调小鼠附睾P34HmRNA和蛋白的表达并减少小鼠精子P34H阳性表达率。4.附睾蛋白P34H基因沉默可抑制小鼠附睾中精子顶体反应率、顶体酶活性、透明质酸酶活性和体外受精率。