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磷脂酶Cβ1的表达对肝细胞癌细胞增殖及预后的影响

褚亚  
【摘要】:目的:通过研究磷脂酶Cβ1(Phospholipase Cβ1,PLCβ1)在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)细胞和组织中的表达及其与临床特征的关系,探讨其对HCC细胞增殖及预后的影响。方法:(1)对5种肝细胞癌细胞株(H7402、Hep3B、LM3、HepG2、Huh7)和正常肝细胞株(L02)进行细胞培养,提取RNA、蛋白后通过RT-PCR和WB检测细胞中PLCβ1对应的mRNA水平和蛋白水平的表达情况,比较癌细胞与正常肝细胞间的PLCβ1表达差异;(2)采用RNA干扰技术构建过表达PLCβ1基因的HepG2、Huh7细胞系,通过CCK-8检测细胞活力,比较肝癌细胞系和对照组间的活力,同时检测Caspase-3/7活性,明确细胞凋亡及生长状态,最后通过克隆形成实验验证PLCβ1在肝癌细胞系生长中的作用;(3)采用RNA干扰技术构建沉默PLCβ1基因的Hep3B、LM3细胞系,通过WB筛选出能够有效沉默PLCβ1基因的ShRNA,之后通过CCK-8检测细胞活力,比较肝癌细胞系和对照组间的活力,最后通过菌落形成测定实验检测沉默PLCβ1基因对两组细胞生长的影响;(4)分别构建过表达PLCβ1基因的HepG2、Huh7细胞系和沉默PLCβ1基因的Hep3B细胞系后,通过WB检测ERK的激活状态,进一步研究PLCβ1的致癌机制;(5)收集2010年1月~2017年1月在我院住院并经过病理科诊断为肝细胞肝癌(HCC)的患者的组织样本,共141例,通过免疫组化的方法对141例HCC患者肿瘤组织和癌旁组织PLCβ1的表达进行分析,并对其进行Kaplan Meier曲线与总生存期(OS)分析、Cox回归分析,探讨PLCβ1的表达与临床病理特征之间的关系;(6)采用SPSS 19.0统计学软件(IBM,USA)和Graph Pad Prism 5进行统计分析和图形显示,计量资料以均数±标准差((?)±s)表示,两组均数的比较采用配对t检验分析,计数资料用率表示,采用Χ~2检验或Fisher确切概率法进行分析,P值小于0.05认为差异具有统计学意义。结果:(1)肝细胞癌细胞系中的PLCβ1对应的mRNA表达水平均比正常肝细胞LO_2高(t=4.50,p0.05),其蛋白质的表达水平均比正常肝细胞LO_2高(t=4.30,p0.05);(2)过表达PLCβ1基因细胞的细胞活力比对照细胞要明显增高(t=4.58,p0.05),过表达PLCβ1的HepG2和Huh7细胞其生长能力比对照组增强(t=4.20,p0.05),PLCβ1过表达组的半胱天冬酶3/7(Caspase-3/7)的活性显著降低(t=4.40,p0.05);(3)SH-1和SH-2细胞的Caspase-3/7活性比对照shRNA细胞增高(t=4.92,p0.05),沉默PLCβ1能抑制肝癌细胞的恶性表达;(4)PLCβ1在肝细胞癌细胞中可调节ERK的活化信号传导,ERK的激活促进了PLCβ1的致癌活性;(5)肝细胞癌组织标本的细胞核和细胞质中均检测到了PLCβ1蛋白,癌组织中的PLCβ1蛋白比癌旁组织的表达明显增高(t=5.05,p0.05);PLCβ1的表达与肝癌巴塞罗那(BCLC)分期有显著相关性(Χ~2=6.690,p=0.0145);PLCβ1表达阳性的肿瘤患者比阴性表达的患者生存率低、平均生存时间明显缩短(t=5.01,p0.05);PLCβ1的显著表达是与HCC患者生存期明显相关的独立预后因素。结论:(1)PLCβ1过表达可以促进肝细胞癌细胞增殖并抑制其凋亡;(2)PLCβ1可能通过激活ERK信号通路进而影响肝癌细胞的生长和凋亡;(3)肝癌组织中PLCβ1的过表达与HCC的分期及生存期密切相关,可能是HCC预后的一个独立影响因子;PLCβ1能否作为HCC分子靶向治疗新的候选靶标尚需进一步研究。


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