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栀子、宾川乌头化学成分及栀子抗帕金森病药理活性研究

王雅溶  
【摘要】:目的:高速逆流色谱(HSCCC)法分离纯化栀子药材中环烯醚萜苷及西红花苷化合物,宾川乌头中主要生物碱,并对分离所得的化合物进行结构鉴定。建立测定含栀子中成药中栀子苷和西红花苷-1含量的超高效液相色谱(UPLC)法。研究栀子抗帕金森病(PD)药理活性及机制。方法:(1)HSCCC法分离纯化栀子药材中环烯醚萜苷及西红花苷化合物,宾川乌头中主要生物碱,考察溶剂体系、固定相流速、主机转速、温度等因素对HSCCC分离效果的影响。UPLC测定分离所得化合物纯度,核磁共振氢谱、碳谱(1H-NMR、13C-NMR)、电喷雾离子源高分辨串级飞行时间质谱(ESI-QTOF-MS)对化合物结构进行鉴定。(2)UPLC法测定6种含栀子的中成药(清火栀麦片、栀子金花丸、妇科分清丸、芎菊上清片、解郁安神颗粒、羚羊清肺颗粒)中栀子苷和西红花苷-1的含量。(3)C57 BL/6雄性小鼠分为5组:正常对照组(Control),模型组(Model),栀子提取物(GJE)低、中、高剂量组(25、50、100 mg/Kg)。腹腔注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP),建立小鼠帕金森病(PD)模型。以爬杆法、转轴法和拉力法评价PD小鼠的行为学能力,免疫组化法(IHC)观察酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞数,ESI-QTOF-MS法检测纹状体多巴胺及其代谢产物含量,酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定小鼠血清中三种炎症因子及二胺氧化酶(DAO)含量。结果:(1)采用HSCCC法以正丁醇-乙醇-水(10:1:10,v/v)、乙酸乙酯-正丁醇-水(2:1.5:3,v/v)、正己烷-乙酸乙酯-正丁醇-水(1:2:1:5,v/v)、正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(0.3:1:0.3:1,v/v)为溶剂体系从栀子中分离得到羟异栀子苷、6β-羟基栀子苷、栀子苷酸、栀子苷、西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3、西红花苷-4、Gardecin。纯度分别为91.7%、93.4%、92.5%、98.2%、94.1%、96.3%、94.1%、98.9%和97.4%。(2)采用HSCCC法以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水-氨水(1:1:1:1:0.1,v/v)为溶剂体系从宾川乌头分离得到苯甲酰乌头碱、N-去乙基乌头碱、乌头碱、去氧乌头碱、宾乌定甲。纯度分别为98.4%、97.2%、98.2%、96.8%和96.6%。(3)6种中成药中栀子苷平均含量分别为3.58、5.32、2.17、4.57、1.23、0.38 mg/g;西红花苷-1平均含量分别为1.52、1.06、0.35、0.55、0.068、0.099 mg/g。被测定的两种成分色谱峰均有良好的分离度,方法精密度、重复性、稳定性良好。(4)与对照组小鼠相比,MPTP组小鼠爬杆时间变长(P0.05)、转轴时间缩短(P0.001)、拉力减小(P0.01);酪氨酸羟化酶免疫反应减少(P0.01);纹状体多巴胺及其代谢产物水平降低(P0.001);血清中三种炎症因子含量增多(P0.001);DAO含量明显减少(P0.001)。与MPTP组相比,GJE中、高剂量给药组小鼠爬杆时间缩短(P0.05)、转轴时间延长(P0.001)、拉力增大(P0.05)、TH免疫反应增加(P0.01)、纹状体中多巴胺及其代谢产物水平明显提高(P0.05)、血清中三种炎症因子含量减少(P0.01)、DAO含量增加(P0.01)。结论:(1)本研究建立了HSCCC法从栀子分离得到9个化合物单体,为栀子的药理研究和质量控制奠定基础。(2)本研究建立了HSCCC法对宾川乌头中的主要生物碱进行了分离,为宾川乌头中主要生物碱的生物活性和毒理学研究提供基础。(3)实验建立了20 min内快速鉴定并测定6种含栀子中成药中栀子苷和西红花苷-1的方法。方法准确、简便、快速,可做为以上6种中成药中栀子苷和西红花苷-1的含量测定方法。(4)GJE可以改善MPTP诱导的大鼠运动障碍并可显著抑制MPTP诱导的多巴胺能神经元损伤。GJE可能通过抑制小胶质细胞活化,减少炎症因子的表达而保护DA能神经元。


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