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丹参酮ⅡA配伍DAPT对肾纤维化过程中Notch1/Jagged1信号通路的干预作用

徐静雅  
【摘要】:目的:研究丹参酮ⅡA与DAPT配伍对UUO大鼠肾组织与白蛋白诱导人肾小管上皮细胞(HK-2)中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转化生长因子-β(TGF-β)等蛋白以及Notch1/Jagged1信号途径的干预作用,证实丹参酮ⅡA配伍DAPT防治肾纤维化的疗效机制,为中西药物组分配伍走向临床提供理论基础和实验依据。方法:1.40只雄性SD大鼠采用单纯随机抽样分组方法分为5组,即正常组、模型组、丹参酮ⅡA组、γ-分泌酶抑制剂(DAPT)组、丹参酮ⅡA配伍DAPT组(简称丹参酮ⅡA+DAPT组)。造模后给予相应药物干预14 d。检测大鼠肾小管功能指标:尿微量白蛋白(UMA)、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)的含量,观察肾组织病理。免疫组织化学方法(IHC)检测α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原(ColⅠ)的变化。实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测Notch 1 mRNA、Jagged 1 mRNA的表达情况。免疫印迹法(WB)检测Notch 1、Jagged 1、α-SMA、TGF-β、CTGF的蛋白表达。2.HK-2细胞传代培养同步化后同样分为以上五组,除正常组外均给予过量人血清白蛋白(HSA)造模处理,且3个给药干预组予相应药物干预48 h后采取细胞免疫荧光检测Notch 1、Jagged 1、α-SMA、TGF-β及CTGF蛋白的定位表达;WB检测:Notch 1、Jagged 1、α-SMA、TGF-β及CTGF蛋白表达。结果:1.各组大鼠肾小管功能检测结果:与正常组比较,模型组尿NAG与UMA含量均显著升高(P0.05);与模型组比较,各药物干预组UMA明显降低(P0.05),各药物干预组尿NAG无显著差异(P0.05)。2.各组大鼠肾脏病理结果:模型组肾脏组织呈肾小管萎缩,小管间质明显增宽,Masson染色可见大量胶原纤维弥漫分布。各用药干预组均较模型组病理有所改善,且HE与Masson评分显著降低(P0.05),丹参酮ⅡA+DAPT组效果最明显。3.免疫组化检测肾组织结果:与正常组比较,模型组肾组织α-SMA和ColⅠ平均光密度值显著升高(P0.05);与模型组比较,各药物干预组α-SMA和ColⅠ平均光密度值均明显下降(P0.05);各药物干预组间比较,丹参酮ⅡA+DAPT组效果最明显(P0.05)。4.RT-PCR检测肾组织结果:与正常组比较,模型组肾组织Notch 1和Jagged 1mRNA相对表达显著升高(P0.05);与模型组比较,各药物干预组肾组织Notch 1和Jagged 1mRNA相对表达显著降低(P0.05)。丹参酮IIA+DAPT组Jagged 1mRNA的相对表达低于丹参酮IIA组(P0.05),与DAPT组无显著性差异(P0.05)。丹参酮IIA+DAPT组大鼠肾组织Notch 1mRNA相对表达较丹参酮IIA与DAPT组显著降低(P0.05)。5.Western blot检测肾组织结果:与正常组比较,模型组大鼠肾组织Notch 1、Jagged 1、α-SMA、TGF-β及CTGF蛋白相对表达量显著升高(P0.05);与模型组比较,各用药干预组肾组织Notch 1、Jagged 1、α-SMA、TGF-β及CTGF蛋白相对表达量显著降低(P0.05),丹参酮IIA+DAPT组肾组织Notch 1、α-SMA、TGF-β蛋白相对表达量较丹参酮IIA与DAPT组显著降低(P0.05)。体外实验结果6.免疫荧光检测HK-2细胞结果:HK-2细胞核的荧光信号为蓝色,而Notch 1、Jagged 1、α-SMA、TGF-β、CTGF阳性表达的荧光信号为红色。Notch 1、Jagged 1、α-SMA、CTGF在各组细胞胞浆区域可见不同程度红色荧光,TGF-β在各组细胞胞核区域可见不同程度红色荧光,说明Notch 1、Jagged 1、α-SMA、CTGF主要表达在HK-2细胞的胞浆,TGF-β主要表达在HK-2细胞的胞核。7.Western blot检测HK-2细胞结果:与正常组比较,模型组细胞Notch 1、Jagged 1、α-SMA、TGF-β、CTGF蛋白相对表达量显著升高(P0.05);与模型组比较,各用药干预组细胞Notch1、Jagged 1、α-SMA、TGF-β、CTGF蛋白相对表达量显著降低(P0.05),丹参酮IIA+DAPT组细胞Notch 1、α-SMA、TGF-β、CTGF蛋白相对表达量显著低于丹参酮IIA与DAPT组(P0.05)。各用药干预组间比较,Jagged 1的相对表达量无显著性差异(P0.05)。结论:丹参酮IIA、DAPT及其配伍用药可以减轻UUO大鼠肾组织损害,保护肾小管功能,延缓肾纤维化进程。该机制可能与其降低肾组织α-SMA、ColⅠ表达,减少胶原蛋白的合成;抑制相关纤维化分子TGF-β、CTGF的表达;有效干预肾组织Notch 1、Jagged 1信号通路等多环节有关,从而发挥其多靶点作用,延缓UUO大鼠肾纤维化进程。体外实验检测白蛋白诱导的HK-2细胞进一步证实丹参酮IIA、DAPT及其配伍用药延缓肾纤维化可能与其可以降低相关促纤维化因子表达,干预Notch 1、Jagged1信号途径发挥多环节、多靶点作用有关。


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