仿野生金钗石斛物质基础积累与环境因素相关性研究

【摘要】：目的:通过对不同生长环境对金钗石斛化学成分的影响进行分析,首先考察环境因素对金钗石斛国家药典质量控制指标的影响规律,然后通过高通量次生代谢产物组学研究,考察环境因素对金钗石斛广谱物质基础的影响规律,发现对次生代谢产物合成的关键性影响因素,挖掘出优势化学成分,并结合网络药理学方法对其可能影响的药效进行预判,为金钗石斛质量标准从分析导向提升至药效导向奠定基础。方法:1.不同环境因素下石斛样本的采集:依据产地、海拔、光照因素的不同,分别收集金钗石斛样本。对采集的新鲜金钗石斛样本的茎,进行分离、切段、烘干、称重、粉碎成粉末状,过三号筛。2.金钗石斛国家药典质控指标的测定:按2015版《中国药典》方法,采用0.05%甲酸-甲醇溶液回流提取,利用气相色谱(GC)测定样本中石斛碱的含量,萘为内标,火焰离子化检测仪(FID)为检测器,筛选影响金钗石斛中石斛碱含量的主要环境因素。3.金钗石斛中小分子次生代谢产物组学分析:采用超高效液相色谱四极杆时间飞行质谱联用仪(UPLC-Q/TOF-MS)对金钗石斛的次生代谢产物谱进行高通量检测,并结合文献报道及数据库信息进行结构推定,初步推测优势化学成分的结构。4.网络药理学方法预测金钗石斛优势化学成分的药效:采用网络药理学方法,针对优势化学成分,筛选其相关作用靶点,通过疾病富集分析以及京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析,探讨优势化学成分可能的药理作用及机制。结果:1.样本采集情况:依据产地、海拔、光照三个因素,在贵州赤水、海南海口两地共采集146份金钗石斛样本。2.海拔因素是影响金钗石斛中石斛碱含量的关键因素:按药典方法测定各样本中石斛碱的含量,通过比较发现,在本次采集的样本中,产地和光照因素对结果的影响,不具有统计学意义。生长在海拔692 m的金钗石斛中石斛碱含量明显优于其他海拔(P0.05)。3.海拔因素同样是影响金钗石斛中其他次生代谢产物形成轮廓的关键因素:采用UPLC-Q/TOF-MS技术,建立各样本的次生代谢产物谱。通过PCA分析,进一步发现,在本次采集的样本中,产地、光照因素对次生代谢产物整体轮廓的影响不显著,组间无明显区分。而生长在海拔692 m金钗石斛样本的次生代谢产物整体轮廓,与生长在海拔44 m、338 m、508 m的样本可以区分。4.海拔692 m处金钗石斛的优势化学成分挖掘:通过高分辨质谱结合OPLS-DA分析,与海拔44 m、338 m、508 m相比,在生长于海拔692 m样本中筛选得到11个差异成分。进一步与贵州赤水不同海拔的样本进行比较分析,在海拔692 m样本中筛选得到12个差异成分,两次筛选结果中,有9个共同成分,为海拔692 m金钗石斛潜在的优势化学成分。将其高分辨分子量及二级质谱碎片信息结合数据库及文献报道,推定其中5个为生物碱类化合物、2个为氨基酸衍生物、1个为脂肪族有机酸,1个暂未鉴定出来。5.新发现优势化学成分的靶点筛选与药效预测:通过Swiss Target Prediction数据库对8个优势化学成分进行靶点预测,共筛选出225个靶点。对靶点与优势化学成分构建网络图,以节点度值大于50为阈值,筛选得到3个核心化合物,分别为1-[[(1,1-Dimethylethoxy)carbonyl]amino]-α-hydroxy-3-methoxycyclobutaneacetic acid、2-Methyl-1H-indol-7-yl-β-D-mannopyranoside、6-羟基石斛碱。对225个靶点进行PPI分析,以节点度值大于20为阈值,筛选得到5个核心靶点,分别为MAPK1、EGFR、F2、MAPK8、CHRM2。同时,对225个靶点进行疾病富集与KEGG通路分析,这些优势化学成分可能通过Neuroactive ligand-receptor interaction、Calcium signaling pathway、c AMP signaling pathway、Cholinergic synapse、Serotonergic synapse等通路发挥治疗神经系统、代谢系统、肿瘤等多种疾病的作用。结论:在金钗石斛仿野生种植的实践中,种植产地、光照对金钗石斛品质不具有显著影响,应充分考虑海拔因素对金钗石斛品质的影响。同时,本研究所筛选出的8个优势药效化学成分,可作为药效导向的金钗石斛质量标准制定的重要参考指标。