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按摩动态力学刺激防治肥胖对前脂肪细胞增殖和分化功能的影响及机制研究

周烨泓  
【摘要】:目的:体外培养前脂肪细胞,通过对该细胞进行力学刺激观察按摩动态力学刺激对前脂肪细胞增殖的影响及过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferators-activated receptor PPAR)、转录因子CCAAT增强子结合蛋白(CCAAT enhancer binding protein C/EBP)、脂联素结合受体(AdipodR1、AdipodR2)表达的变化,为推拿按摩可以防治单纯性肥胖提供实验依据,从分子生物角度认识中医推拿作用于人体后前脂肪细胞生物学功能的影响。 方法:1、以清洁级80g-100g(1-2月龄)的SD雄性大鼠(Sprague Dawley Rat)为实验材料,无菌操作采集附睾周围白色脂肪组织,利用酶消化法培养前脂肪细胞,分别从形态学角度和油红0染色技术鉴定前脂肪细胞。将原代前脂肪细胞传代至P3代,作为后续试验的平台。2、将前脂肪细胞随机分为六组,OR/min组、60R/min组、90R/min组、120R/min组、150R/min组、180R/min组。经24h培养同步化后,根据相应的组别加载力不同强度的刺激,每日刺激2次,每次时长30min,间隔时间为12h,连续3日,共计刺激6次。刺激结束后,利用MTT法检测细胞生长活力法检测各组细胞的活力变化。3、重复方法二中对前脂肪细胞的分组加力刺激,刺激结束后,收集细胞提取总RNA,利用RT-PCR半定量技术分析AdipodR1、 AdipodR2、PPAR及C/EBP基因表达的变化;收集细胞提取总蛋白,利用western blot技术分析AdipoR1、AdipoR2、PPAR及C/EBP蛋白表达的变化。 结果:1、原代培养SD大鼠前脂肪细胞成功。油红0染色结果呈阳性。该细胞可成功诱导为成熟脂肪细胞。为整个实验提供了平台。2、将前脂肪细胞分组后,每一次刺激结束都用MTT法检测各组吸光值,通过6次的刺激,画出各组细胞经过不同力度刺激后的生长曲线,观察细胞活力变化,结果随着力学刺激的梯度增大,前脂肪细胞的增殖也受到抑制,并且刺激力度与增殖抑制率成正相关;其中150R/min组与180R/min组虽然细胞活力低于正常组,但在两两比较中无统计学差异。经分析得出结论:按摩力学刺激越大,前脂肪细胞活力越低,增殖抑制率越高(P0.05);高转速组(150R/min组与180R/min组)与其他实验组对比无统计学差异。3、RT-PCR半定量分析各转速组别间的C/EBP、PPAR、AdipodR1、 AdipodR2、基因表达水平的变化,①C/EBP基因的表达:实验组(60R/min组、90R/min组、120R/min组、150R/min组、80R/min组)与对照组OR/min组相比,C/EBP的表达水平均低于OR/min组,且随着刺激力度的增加其表达呈逐步下调趋势,统计分析有显著差异(P0.05)各组两两对比也存在显著差异。PPAR基因的表达:与OR组相比,实验组PAR随着力学刺激的增强表达水平呈下降趋势,有显著差异(P0.05);各组两两对比也存在显著差异。③Adipod R1基因的表达:与OR组相比,实验组Adipod R1随着力学刺激的增强表达水平呈下降趋势,有显著差异(P0.05);各组两两对比也存在显著差异。④AdipodR2基因的表达:与OR组相比,实验组Adipod R2随着力学刺激的增强表达水平呈下降趋势,有显著差异(P0.05);各组两两对比也存在显著差异。4、Western Blot免疫印迹实验分析各转速组别间的C/EBP、PPAR、 AdipodR1、AdipodR2、蛋白表达水平的变化,①C/EBP蛋白的表达:实验组(60R/min组、90R/min组、120R/min组、150R/min组、180R/min组)与对照组OR/min组相比,C/EBP的表达水平均低于OR组,随着力学刺激的增强其表达呈下调趋势,统计学有显著差异(P0.05);各组两两对比也存在显著差异。②PPAR蛋白的表达:与OR组相比,实验组PPAR随着力学刺激的增强其表达水平呈下降趋势,统计分析有显著差异(P0.05);各组两两对比也存在显著差异。③AdipodR1蛋白的表达:与OR组相比,实验组Adipod R1随着力学刺激的增强其表达水平呈下降趋势,统计分析有显著差异(P0.05):各组两两对比也存在显著差异。④AdipodR2蛋白的表达:与OR组相比,实验组AdipodR2随着力学刺激的增强其表达水平呈下降趋势,统计分析有显著差异(P0.05);各组两两对比也存在显著差异。 结论:1、体外模拟推拿按摩动态力学刺激可以抑制前脂肪细胞的增殖。动态力学刺激通过抑制前脂肪细胞的增殖可能是推拿防治单纯性肥胖病症的机制之一2、前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞并且贮存能量是肥胖发生的必经途径。实验显示前脂肪细胞可以感受按摩力学刺激,从而减弱PPAR和C/EBP、Adipod R1、 Adipod R2基因和蛋白的表达,有效的证明了推拿按摩力学刺激可以参与前脂肪细胞分化、进一步证明了,在体外按摩力学的干扰下,前脂肪细胞在向成熟脂肪细胞分化的过程得到了有效地抑制,说明前脂肪细胞可以主动参与和适应生长环境中力学环境的变化这可能是推拿按摩防治肥胖的重要机理之一。


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