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冠突散囊菌对中药材三七成分的转化及机理研究

杜静  
【摘要】:冠突散囊菌(Eurotium cristatum)是茯砖茶发酵过程中的优势益生菌,俗称“金花”,是形成茯砖茶特有风味的决定性菌种。日本科研人员曾把“金花”加工成保健品,价格一度超过黄金,使得冠突散囊菌的保健作用引起越来越多的关注和重视。然而,我国对冠突散囊菌的研究多基于其对茶叶的影响,作为在医学领域具有巨大应用潜力的益生菌,其医药价值却没有引起人们足够的重视,没有得到充分的利用和开发。随着现代医药学对冠突散囊菌的提取工艺、生理特征、药理作用以及临床应用等方面研究的深入,发现冠突散囊菌自身代谢产物丰富,包括各种胞外多糖、氨基酸、茶多酚等等,具有诸多功效,包括降脂减肥、提高人体免疫功能、抗肿瘤、抗氧化等;另一方面其丰富而强大的酶系,包括纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、多酚氧化酶、甘露聚糖酶等,对药用植物活性成分的转化与修饰存在巨大的潜力。因此冠突散囊菌在中药开发方面的应用潜力逐渐凸显,我们认为冠突散囊菌是构建药用真菌和中药发酵组合的最佳菌种之一。三七[Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen]是一种我国常见的名贵中药材,生熟异用,素有“生消熟补”之说,其皂苷类成分丰富,自古以来被广泛应用于治疗各种外伤和补气、补血等。近些年来,随着中药现代化进程的加快,对三七的研究日趋深入,尤其是三七药理作用和炮制应用等方面的研究备受关注。与此同时,结合现代生物技术的发展和各种化学分析技术的进步,越来越多的研究者开始将微生物发酵技术应用于中药炮制,以探索中药方面新药的研发,从而获得副作用小,活性作用更强的新型药剂。而微生物发酵炮制的机理及炮制前后生物活性物质的变化也逐渐引起人们的重视。本研究选用冠突散囊菌作为发酵菌种,应用微生物发酵技术炮制三七,共设置了三组样品,分别为发酵三七,记做FS(其中,在LC-MS中,增加了一组发酵中期三七,记做FS1;故发酵后期三七,记做FS2);未发酵三七,记做WS;大米培养冠突散囊菌,记做DM。对比发酵前后三七化学成分的变化,探索冠突散囊菌对三七的转化作用及机理,有助于对三七的深度开发利用,助推中药现代化,同时进一步发掘冠突散囊菌的潜在价值,促进其开发利用。主要研究结果如下:1、建立了三七与冠突散囊菌的双向固态发酵体系,发现冠突散囊菌在三七基质上长势良好;采用醇提法对发酵产物进行提取,并进行了体外抗氧化能力评测,结果如下:在一定浓度范围内,各样品均对DPPH、ABTS和羟自由基有一定的清除能力。DPPH法中,四者对DPPH自由基清除能力的IC_(50)(mg/m L)平均值分别为Vc 0.0018 mg/m L、FS组2.6047mg/m L、WS组6.3113 mg/m L、阴性对照DM组0.8374 mg/m L,由此可见,发酵后的三七获得了更强的清除DPPH自由基能力;ABTS法中,在0.03125~4 mg/m L的质量浓度范围内,Vc组、FS组、WS组和DM组的IC_(50)(mg/m L)平均值分别为0.06 mg/m L、13.4067 mg/m L、14.4333mg/m L、34.9033 mg/m L。在3.125~50 mg/m L的质量浓度范围内,各样品均对羟自由基也具有一定的清除能力,四者对羟自由基清除能力的IC_(50)(mg/m L)平均值分别为抗FS为6.4213±0.6318 mg/m L,WS为11.8233±0.5050 mg/m L,Vc为11.4033±0.1960 mg/m L,DM为15.9500±2.3797 mg/m L。2、分别采用PNPG法和碘-淀粉显色法测定了各组样品对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制活性。结果如下:在0.0625~2 mg/m L的质量浓度范围内,除DM组样品外,各组样品均对α-葡萄糖苷酶有一定的抑制能力,且表现了一定的剂量依赖性,随样品浓度的增加抑制作用逐渐增强。而DM组样品在此浓度范围下未表现出对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。阿卡波糖、FS组样品和WS组样品对α-葡萄糖苷酶的抑制作用由强到弱依次为:阿卡波糖FSWS;DM组样品和阿卡波糖在0.0625~2 mg/m L的质量浓度范围内,未表现出剂量依赖性,其对α-淀粉酶的抑制率分别维持在37%和25%左右。而FS组样品和WS组样品对α-淀粉酶的抑制作用则随样品浓度的增加而增强,四者对α-淀粉酶的抑制作用由强到弱依次为:FSWSDM阿卡波糖。3、采用高效液相色谱法对发酵前后的三七中的几种最主要的皂苷类成分进行了含量测定,包括三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd。四者在发酵组FS和未发酵组WS(括号中的数值)中单位样品中的平均含量分别为:三七皂苷R1为5.6915 mg/g(3.1814mg/g)、人参皂苷Re为11.1207 mg/g(5.0011 mg/g)、人参皂苷Rb1为19.2661 mg/g(9.1570 mg/g)、人参皂苷Rd为5.5865 mg/g(2.3841 mg/g)。由此可见,发酵后三七中的各物质含量均显著增加。4、对发酵前后的三七进行指纹图谱比对,结果发现在FS组与WS组中检测出较多的物质吸收峰,在DM组中则几乎未检测到吸收峰。根据图谱差异性分析,共标记了11个特殊的物质吸收峰,其中有6个吸收峰(1、2、3、6、8、10号峰)为FS组特有的物质吸收峰,即发酵后新出现的物质;5个吸收峰(4、5、7、9、11号峰)为FS组和DM组特有而WS组没有的吸收峰,即发酵后出现的可能来源于冠突散囊菌的物质。5、对经过UHPLC–Triple TOF/MS分析后获得的原始数据经表达量数据预处理后共注释到代谢物756种,其中有215种代谢物注释到KEGG数据库,673种代谢物注释到的HMDB和Lipidmaps等公共数据库。对注释到HMDB数据库的622种代谢物进行化合物分类统计,共匹配到14个HMDB super classes中,其中有266种代谢物属于“脂类及类脂分子”,115种代谢物属于“有机酸及其衍生物”,两者占了所有HMDB注释代谢物的61%左右。6、在DWS、DFS1和DFS2三组中分别检测到764、866和850种代谢物,其中DWS和DFS1分别特有12种代谢物,DFS2特有28种代谢物。差异代谢物筛选共筛选出385个差异性代谢物,DFS2和DFS1的差异代谢物有263种,其中有96个代谢物上调,167个下调;DFS2和DWS的差异代谢物有261种,其中114个代谢物下调,117个代谢物上调。通过对发酵前后差异代谢物的聚类分析以及KEGG通路富集分析,发现发酵前后代谢物表达量差异显著,DFS2和DWS组差异代谢物的相关代谢通路包括苯丙氨酸代谢、癌症中胆碱代谢、胆汁分泌、甘油磷脂代谢以及苯丙烷生物合成等代谢途径。同时还对不同发酵阶段的代谢物的变化进行了研究,结果表明不同发酵时期,代谢物差异显著,富集到的相关代谢通路为苯丙氨酸代谢、苯丙烷生物合成、亚油酸代谢、癌症中胆碱代谢以及半乳糖代谢等代谢通路。结论:1、冠突散囊菌在纯三七基质上长势良好侧面证明了三七发酵炮制的可行性,为下一步实验打下基础。2、对发酵前后的三七样品进行体外生物活性检测,包括体外降糖作用和体外抗氧化活性,结果表明,经冠突散囊菌发酵,三七的这两个生物活性均得到极大的提高,进一步印证了冠突散囊菌在中药炮制方面的巨大潜力,以及三七发酵炮制的可能性。3、采用高效液相色谱法对发酵前后三七中的几种最主要的皂苷类成分进行了含量测定,包括三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd,结果表明,发酵后四者含量均得到提高,且经指纹图谱比对,产生了6个新的物质吸收峰,初步表明发酵前后化学成分的差异性。4、通过LC-MS分析,进一步明确了发酵前后的物质变化:共筛选出385个差异性代谢物,其中DFS2和DFS1的差异代谢物有263种,DFS2和DWS的差异代谢物有261种,DWS和DFS1分别特有12种代谢物,DFS2特有28种代谢物。


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