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三七根际土壤微生物的群落特征

苗翠苹  
【摘要】:三七(Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen)为五加科人参属植物,是我国特有的名贵中药材,具有止血散瘀、定痛消肿的功效。三七长期庇荫,潮湿,免耕作的生活环境造成了土壤环境的微生态失衡,以根腐病为主的土传病害日益突出,至今仍未得到有效的缓解。研究三七根际土壤的微生物的群落组成及多样性将为该类土传病害的发生、传播、有效治理及解决三七连作障碍提供重要依据。 本文采用MiSeq高通量测序和qPCR方法,研究三七栽培过程中根际真菌、细菌的群落结构和丰度动态,通过与环境理化因子进行相关性分析,阐明驱动根际微生物类群动态变化的关键因子;比较三七根腐病与健康植株根际土壤真菌、细菌群落结构的差异,寻找与发病有关的微生物因子。通过纯培养,分析其可培养真菌、细菌的多样性及种群分布,以三七病原菌为靶标,筛选防治根腐病的活性资源。结果如下: 一、样品信息2012年4月至2013年10月间,每年4月和10月两个生长高峰期于砚山三七试验田采集健康三七根际土壤(共4份),每一份取小份用于高通量测序及荧光定量PCR,来研究三七栽培过程中根际真菌、细菌的群落结构及丰度动态。一小份用于传统的真菌和放线菌的分离,用于研究纯培养真菌和放线菌的种群分布及多样性,所分离到的菌株进一步用于三七根腐病生防资源的筛选。剩余部分用于分析土壤理化性质。 分别于砚山试验田和金川种植大田中采集黄腐型和急性青枯型根腐病三七根际土样,以及各自作为对照的健康三七根际土样,用于分析根腐病发病植株根际微生物群落结构,并与健康组作比较,研究引起根腐病发生的微生物因子。 二、荧光定量PCR分析表明三七根际土壤中真菌和细菌的数量均在移栽半年前显著增加,随后逐渐减少,一年半后数量翻倍增加。Pearson相关性分析显示真菌数量与土壤含水量显著正相关(R=0.912,p0.05)。香农多样性指数表明,真菌多样性开始随真菌数量的增多而降低,半年后随真菌数量的减少而上升,但是在一年半后随着数量的增加明显升高;细菌多样性半年前随着其数量的增多而升高,之后随其数量减少而降低,仍然在一年半后大幅提高。高通量数据分析显示三七根际土壤微生物群落呈明显的动态变化,真菌群落中有大量的被孢霉(Mortierella)类群存在,其在移栽半年时丰度显著提高,之后逐渐降低一年半后趋于平稳,Fusarium丰度变化幅度不大。在门分类水平上,Ascomycota和Zygomycota为优势类群,Zygomycota的变化随Mortierella的变化而变化,而Ascomycota丰度则在移栽半年前骤减,之后逐步增多。细菌群落以Proteobacteria和Bacteroidetes为优势类群,Proteobacteria丰度随时间增长逐渐升高,而Bacteroidetes丰度则随时间增长逐渐降低。随着种植周期的增长,病原菌种类增多,有益菌减少,三七生长环境日趋恶化。Pearson相关性分析和冗余分析表明主要真菌类群受土壤中总氮(TN)的影响,但均未达到显著水平;总磷(TP)、有效磷(AP)和水解氮(AHN)是影响细菌群落结构的重要因子。 三、对砚山和马塘两地的根腐病三七根际微生物群落结构进行了研究。荧光定量PCR显示根腐病三七根际土壤中真菌和细菌的数量均高于健康对照。与健康植株的相比,病株根际真菌、细菌群落结构发生了明显的变化,主要表现为根际土壤中Mortierella丰度大幅下降,多种病原菌大量增殖而成为优势类群。优势真菌病原有Fusarium、Ilyonectria、Cylindrocarpon、Volutella、Mycocentrospora、 Botryotinia、Monographella及其有性型Microdochium,优势细菌病原有Pseudomonas、Flavobacterium。三七根腐病的发生与这些病原菌的积累有密切的关系,并且呈现多种病原并存的现象。 四、采用传统分离方法,从三七根际土壤中共获得了225株真菌,通过形态学特征和ITS基因系统发育分析,这些菌株分布在5纲(Sordariomycetes、 Dothideomycetes、Eurotiomycetes、Leotiomycetes和Zygomycetes)、13目、25科,共52个属内86个物种及3个未确定属的物种,其中有7株代表潜在的新物种。Sordariomycetes菌株占总鉴定物种数55.11%。获得了292株放线菌,16S rRNA基因的系统发育分析结果显示,选取的60株代表菌株分属于7个亚目(Streptomycineae、 Corynebacterineae、Micromonosporineae、Micrococcineae、Streptosporangineae、 Propionibacterineae、Pseudonocardineae),11个科共17属,有8株可能代表潜在的新物种,Streptomycineae占总数的70.34%。其中也获得了一些高通量测序没有检测到的物种,充分体现了三七根际土壤中纯培养真菌、细菌丰富的多样性,同时也蕴藏着较为丰富的新的微生物资源。 五、以腐皮镰孢(Fusarium solani)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、人参链格孢(Alternaria panax)、草茎点霉(Phoma herbarum)、黄瓜萎蔫病菌(Plectosphaerellacucumerina)为靶标,进行分离真菌、放线菌菌株的活性筛选,结果显示有13株真菌、21株放线菌显示出至少对一种病原菌有活性,活性菌株占供试菌株的22.1%,放线菌的活性普遍比真菌强,表明三七根际土壤中有大量的可用资源。 本论文首次免培养与纯培养微生物相结合的方法,初步揭示了三七根际土壤的微生物的群落组成及变化规律,以及土传病害的发生规律,为解决三七连作障碍提供了重要的实验依据。筛选到一批抗三七病害高活性菌株,为三七土传病害的有效防治和研发新型生物制剂提供宝贵菌种资源。


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