微囊藻毒素-LR酶联免疫法的开发研究

【摘要】： 酶联免疫吸附分析(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)建立于1971年,并用于医学研究。微囊藻毒素的ELISA分析国外应用得早一些,国内也有应用,但不如国外成熟。本文以微囊藻毒素-LR的酶联免疫分析作为探讨对象,内容包括微囊藻的毒素-LR的提取与纯化、微囊藻毒素-LR的完全抗原化、以及微囊藻毒素-LR单克隆抗体细胞株的筛选培养。 (1)通过对从滇池捞取的新鲜藻样过筛选取、冷冻干燥制得蓝藻藻粉;用醋酸溶液破坏蓝藻细胞壁,使藻毒素溢出细胞;通过C18柱子的浓缩富集作用,用80%的甲醇溶液洗脱并收集藻毒素的提取液;对藻毒素提取液进行液相色谱分离分析,确定MC-LR保留时间为30min～31min,收集MC-LR分离液,浓缩、过C18柱纯化MC-LR,得到MC-LR粗提取液,在荧光硅胶薄层板的进一步精密分离下,得到MC-LR精制样品;通过液相色谱-质谱仪(LC-MS)鉴定,采用外标法计算,得到纯度为98.79%的MC-LR精制样品。本试验一共提取MC-LR精制样品6.4mg。 (2)MC-LR的分子量为995.2D,是典型的半抗原。在免疫反应过程中,只有反应性没有免疫原性,为使MC-LR具有免疫原性,我们利用蛋白质的偶联技术,使其在动物免疫的过程中产生有效的免疫应答。本文首先用二巯基乙胺活化MC-LR,在MC-LR的第七位氨基酸脱氢丙氨酸的双键位置引入一个氨基,然后选用分子量为67000D的牛血清白蛋白(BSA)为载体蛋白,通过戊二醛两步法使MC-LR与BSA得到耦联。通过生物质朴法对中间产物H2N-etMC-LR的分子量进行了鉴定,确定MC-LR的活化很成功;分别通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术、基质辅助激光解析电离飞行时间质朴(MALDI-TOF-MS)检测,对偶联物MC-LR-BSA进行定性、定量鉴定。结果显示,耦联比在3～18:1之间,平均耦联比为8:1。 (3)选用已鉴定的MC-LR-BSA免疫Balb/c实验小鼠,按100ug/只进行腹腔注射,加强免疫3～5次,每隔两周加强免疫一次,得到了效价为接近1:25600的血清。采用杂交瘤技术,取脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合,用HAT选择性培养基进行选择培养,利用间接ELISA法筛选阳性细胞孔,将筛选出的阳性细胞进行细胞克隆欲获得稳定的细胞株,扩大培养。运用间接ELISA法测定MC-LR的最适包被浓度为10ng～20ng/孔。