收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

丙型肝炎病毒对树鼩原代肝细胞感染性的研究

薛梅  
【摘要】:丙型肝炎病毒是导致慢性丙型肝炎,肝硬化、肝纤维化甚至肝细胞癌的主要病原体。根据世界卫生组织1999年统计,全球约有1.7-2.0亿人感染HCV,我国丙型肝炎病毒的感染率为3.2%,属HCV中高度感染区。除人和黑猩猩是丙型肝炎病毒的自然宿主,至今尚未发现其他自然动物对HCV易感。理想的HCV小动物模型缺乏,严重制约了丙型肝炎相关致病机制的研究,也导致了尚无可完全治愈的临床药物和有效预防的疫苗。2005年高效的HCV病毒细胞培养体系的建立,使得一次性得到背景一致、病毒滴度高的HCV病毒成为可能;其中Charles Rice所构建的J6/JFH1病毒株已经被证实对黑猩猩有较高的感染性。但由于黑猩猩购买、饲养成本较高,亟待发现、开发新的丙型肝炎小动物模型。树鼩是主要分布于我国云南地区,体型较小,繁殖较快的低等灵长类动物。已有研究提示,树鼩可被HCV患者的血清感染,但是由于HCV患者血清的来源不明、病毒滴度较低、树鼩个体背景复杂等原因,丙型肝炎病毒对树鼩的感染性未被最终证实。 本研究以人工驯化、繁育的树鼩为实验对象,采用二步灌流、胶原酶消化法,分离、获得树晌原代肝细胞(PTH),用含生长因子的特殊培养基,长期培养PTH。分离获得的PTH,经过2-3天的适应期,逐渐进入对数生长期,培养8-10天后,肝实质细胞开始出现衰老凋亡。培养12天后,肝实质细胞逐渐减少,混杂的纤维状细胞迅速生长。培养过程中的原代肝细胞,用MTT法检测细胞活力,绘制细胞生长曲线,并用倒置显微镜观察细胞形态。丙酮酸氧化酶法检测PTH培养上清中ALT变化水平,发现第2天后ALT水平明显下降,随后一直维持在低水平。较低的转氨酶水平等相关肝功代偿性指标,说明胶原酶消化及相关细胞处理过程对细胞造成的损伤较小。 采用J6/JFH1-Huh7.5.1细胞病毒培养体系,培养获得了病毒载量为108IU/ml以上、病毒滴度为106ffu/ml以上的病毒,用于感染生长状态良好的PTH。荧光定量PCR检测培养上清中HCV病毒载量最高可达4×105IU/ml。利用逆转录巢式PCR法,可间歇性检测到培养上清中HCV RNA。利用间接免疫荧光法检测PTH内HCV蛋白的表达,可以观察到HCV感染的PTH发出特异性绿色荧光,证实HCV抗原可在感染细胞中表达。PTH产生的二代HCV感染Huh7.5.1细胞,可在培养上清中检测到较低水平的HCV RNA,说明被HCV感染的PTH所产生的HCV病毒具有感染性。PTH所产生的感染性HCV,可以在PTH中进行病毒传代,第二代病毒与第一代病毒载量水平相当。培养上清中HCV RNA经核酸序列测定,发现5'NCR-C区段、E1-E2区段与J6/JFH1嵌合病毒中的J6对应基因区段高度同源,NS5B区段与嵌合病毒J6/JFH1中JFH1对应基因区段同源,但该区段存在细胞适应性突变I2750M。 综上所述,本研究以人工驯化、繁育的树鼩为实验对象,利用二步灌流、胶原酶消化法,获得了生长状态良好的树鼩原代肝细胞,可以满足后续感染实验的要求。病毒核酸定量和定性检测,以及蛋白质水平检测均表明,树鼩原代肝细胞可被J6/JFH1病毒感染,并支持HCV病毒的培养传代,病毒增殖过程中存在HCV基因突变。这些实验结果为树鼩做丙型肝炎病毒小型动物模型,提供了实验依据,并且有助于研究HCV感染与复制的机制。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 谢志春,高伟志,苏洁寒,邬质彬,徐国城,Jose Ignacio,Riezu Boj,Jesus Prieto;树鼩对丙型肝炎病毒的易感性研究[J];广西医科大学学报;2000年03期
2 张海林,米竹青,施华芳,自登云;树鼩实验感染基孔肯雅病毒的研究[J];病毒学报;1991年02期
3 苏建家,罗丹,黄定瑞,黄国华,杨春,严瑞琪;用原位杂交对树鼩肝组织乙型肝炎病毒DNA定位及其与黄曲霉毒素B_1在肝癌发生中的作用[J];肿瘤;1993年06期
4 叶峻;;树鼩伏隔核颅内定位[J];解剖学杂志;1993年02期
5 柴慧霞,谢扬高,陈启贤,黄云;合成新药SC1001胺盐对抗马桑内酯所致树鼩癫痫和镇静作用的研究[J];四川大学学报(医学版);1989年01期
6 苏建家,王憬惺,杨春,黄国华,班克臣,罗小玲,杨显福,严瑞琪;树鼩对人乙型肝炎病毒实验感染的量反应[J];胃肠病学和肝病学杂志;1995年03期
7 吕新跃,陈保生,王克勤;树鼩肝组织cDNA文库的快速构建[J];武警医学院学报;1998年01期
8 李文琦,周激文,李欣,周天禄,钟咏梅,李霞,苏兆虞;树鼩皮质醇测定的研究[J];放射免疫学杂志;1999年01期
9 冼苏,黄松,秦映芬,罗佐杰,韦敏怡,欧超,苏建家;链脲佐菌素诱导树鼩糖尿病动物模型研究[J];广西医科大学学报;2000年06期
10 陈保生,王克勤,王健美,佘铭鹏,卢耀增,夏人仪,吕寿和,赵三妹,刘佩毛,刘连生,安维明,冉碧芳,谷素敏,陶保卫;树鼩血清高密度脂蛋白和低密度脂蛋白物理化学性质的研究[J];基础医学与临床;1983年05期
11 归航,袁建刚,蔡良琬;臭鼩DNA高重复顺序的研究同树鼩的TSr(Bg1 ll)—1顺序比较[J];中国生物化学与分子生物学报;1987年05期
12 吴小闲,唐恩华,张新生,徐维明,谢广珍,文喻玲,刘名英,肖慧芳,涂新明,蒋虹,施慧君,曲丽荣;树鼩腺病毒(Ⅰ和Ⅱ型)的生物学性状、抗原关系和血清抗体的研究[J];中国医学科学院学报;1990年02期
13 吴一迁,于永梅,陈建泉,罗海涛,姚明,成国祥,钱耕荪;肌注前列腺素提高非繁殖期树鼩的受孕率[J];上海实验动物科学;2001年03期
14 李家立,李树清;树鼩血栓性脑缺血时单胺氧化酶(MAO)活性的变化及银杏内酯B作用机理的探讨(摘要)[J];昆明医学院学报;2000年04期
15 陶立新;“HBV和AFB_1与PHC发生关系在树鼩的实验研究”获奖[J];中国肿瘤;1994年01期
16 郭泽云,彭庆廉,刘汉武;加压素样神经元在树鼩、大鼠、豚鼠下丘脑室旁核的分布与比较[J];昆明医学院学报;1995年04期
17 吴钢,陈保生;树鼩血清载脂蛋白A-I的分离纯化及其N端部分氨基酸残基序列的测定(简报)[J];中国医学科学院学报;1994年05期
18 闵峰!361000,郝飞,刘冰,刘国栋,宋志强,王宇明,宋闽宁!361000;丙型肝炎病毒体外感染成年树鼩肝细胞的初步研究[J];肝脏;2001年S1期
19 蔡良婉,黄秉仁,王丹平,阎珺;树鼩高重复顺序TSr(Bgl-Ⅱ)-1的核苷酸顺序分析及与灵长类α-顺序的比较[J];中国生物化学与分子生物学报;1986年02期
20 苏军达,刘世熠;树鼩下丘脑视交叉上核传入联系的研究[J];神经解剖学杂志;1995年04期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 曹筱梅;贲昆龙;谢云华;;促性腺激素诱导树鼩排卵[A];西部大开发 科教先行与可持续发展——中国科协2000年学术年会文集[C];2000年
2 龚敏;;体外培养树鼩视网膜Mller细胞的实验研究[A];中国病理生理学会第九届全国代表大会及学术会议论文摘要[C];2010年
3 郭学军;邹移海;;升降散在建立流感病毒树鼩模型中的作用初探[A];首届中国中医药实验动物科技交流会论文汇编[C];2002年
4 郭小芳;蒙碧辉;陆丽莹;;罗格列酮对非酒精性脂肪肝病树鼩肝细胞PPARγ表达的影响[A];中华医学会第十次全国内分泌学学术会议论文汇编[C];2011年
5 张川荛;李树清;;后适应对树鼩血栓性脑缺血时神经保护效应的比较研究[A];第八届海峡两岸心血管科学研讨会论文集[C];2011年
6 郭泽云;杨力;李素华;吴春云;战雅;;树鼩、大鼠、豚鼠正中隆起后叶加压素样神经纤维的分布[A];解剖学杂志——中国解剖学会2002年年会文摘汇编[C];2002年
7 王茜;李树清;;后适应对树鼩脑缺血后心脏功能异常改善作用的研究[A];第八届海峡两岸心血管科学研讨会论文集[C];2011年
8 李海燕;黎家敏;李靖潇;王新兴;代解杰;;高糖高脂饲料联合地塞米松诱发树鼩血糖、血脂异常[A];第九届中国实验动物科学年会(2010新疆)论文集[C];2010年
9 李树清;李家立;杨丽君;;树鼩实验性瘀症时半暗区PAF受体与MAO活性改变的相互关系[A];第五次全国中西医结合血瘀证及活血化瘀研究学术大会论文汇编[C];2001年
10 李树清;陈静;张颖;李凡;;后适应改善树鼩缺血海马神经元微环境对线粒体应激的影响[A];中国病理生理学会第九届全国代表大会及学术会议论文摘要[C];2010年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 蒙碧辉;糖尿病骨骼肌病变及其发病机制的实验和临床研究[D];重庆医科大学;2003年
2 周勇;水动力转染技术在IFNβ-Luc小鼠模型与HBV树鼩模型研究中的应用[D];中国人民解放军军事医学科学院;2011年
3 汤諹;PI-3K/Akt信号转导在树鼩脑缺血及后适应中的作用机制研究[D];昆明医学院;2008年
4 张晶晶;树鼩、小鼠HBx、ras转基因模型及体外HBV感染模型的研究[D];广西医科大学;2008年
5 李飞;亚低温后适应对树鼩局灶性脑缺血VEGF表达及神经元抗凋亡机制的研究[D];昆明医学院;2010年
6 雷玉洁;转化生长因子β1、ica操纵子对肺癌患者生物材料细菌生物膜形成的影响[D];昆明医科大学;2012年
7 张颖;树鼩血栓性脑缺血海马神经元损伤与线粒体应激机制的研究[D];昆明医学院;2006年
8 冯蕊;缺血后适应对树鼩血栓性脑缺血TLR4介导的缺血耐受机制的研究[D];昆明医学院;2011年
9 徐玉善;luxS在葡萄糖诱导的生物材料表面细菌生物膜形成与分离中的作用[D];昆明医科大学;2012年
10 李卫华;表达HCV-NS3抗原的重组腺病毒载体疫苗的实验研究[D];四川大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 薛梅;丙型肝炎病毒对树鼩原代肝细胞感染性的研究[D];昆明理工大学;2010年
2 王佳;树鼩体内感染丙型肝炎病毒的实验研究[D];广西医科大学;2012年
3 李尧;HCV在树鼩原代肝细胞中感染与转染受体辅助感染的研究[D];昆明理工大学;2012年
4 王新兴;野生树鼩病毒自然感染调查及普通级实验树鼩病毒监测指标的研究[D];北京协和医学院;2011年
5 王琦;新生期树鼩感染人乙型肝炎病毒模型的优化[D];广西医科大学;2010年
6 曾兴光;乙肝病毒体内外感染模型的建立及其在乙肝新药药效学评价中的应用[D];第三军医大学;2010年
7 王东坤;树鼩肺癌模型与生物材料植入感染关系的初步研究[D];昆明医学院;2010年
8 田展飞;HCV感染性克隆体内转染树鼩的初步研究[D];华中科技大学;2006年
9 哈迪;糖尿病树鼩早期肝损害中TGF-β_1的意义[D];广西医科大学;2001年
10 贺猛;3-甲基胆蒽与二乙基亚硝胺对树鼩支气管上皮影响的研究[D];昆明医学院;2011年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者 黄才刚;树鼯是乙肝研究理想动物模型[N];健康报;2000年
2 记者贾晓惠 通讯员黄显斌 唐明山;我国首次发现丙型肝炎病毒新基因[N];科技日报;2002年
3 记者 王江;俄罗斯科学家发现丙肝病毒会伤害中枢神经[N];科技日报;2000年
4 记者 张新生;巴拟推广自主研发新型验血方法[N];科技日报;2008年
5 李向;癌症的危险因素[N];卫生与生活报;2009年
6 编译 姚雨;新抗体可预防丙肝病毒感染[N];医药经济报;2009年
7 张刚强;生物医学和药物研究动物模型规划研讨会召开[N];中国医药报;2010年
8 张汝金 肖鑫 本报记者 黄华敏;拼搏在医学科技前沿[N];解放军报;2002年
9 张加;FDA 批准HCV抗体快速血液检测试剂[N];中国医药报;2010年
10 庄愉;丙肝用药:一个需求远未满足的大市场[N];医药经济报;2010年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978