基于在线高效液相色谱技术的中药抗氧化活性成分的快速筛选

【摘要】：抗氧化剂不仅在人类疾病的预防和治疗中起着重要的作用,而且是食品和工业制品中的重要防腐剂。鉴于人工合成抗氧化剂存在潜在毒性和致癌作用,研究者们更加关注于从丰富的中草药资源中寻求高效、低毒的天然抗氧化剂。评价抗氧化活性的方法多种多样,每种方法都各有其优缺点和适用范围。二十世纪九十年代末,色谱分析和抗氧化活性测定联用法的引入实现了化合物分离和活性检测同时进行,该法能快速筛选混合物中多种物质的抗氧化性,并通过液质联用(LC-MS)初步推断化合物结构,解决了传统活性药物筛选方法效率低、工作量大、化合物易变性等问题。本论文建立了HPLC-ABTS和HPLC-DPPH两种在线检测抗氧化活性成分的方法,并利用其检测了我国传统中药灯盏花和三种鼠尾草(云南鼠尾草、甘西鼠尾草和栗色鼠尾草)中的抗氧化性成分,并对HPLC-ABTS和HPLC-DPPH两种方法的优劣进行了比较。本论文的主要研究内容及研究结果如下： (1)离线方法测定灯盏花70%甲醇提取液对DPPH和ABTS自由基有不同程度的抑制作用,且活性均小于阳性对照药VC。 (2)通过在线HPLC-ABTS法和HPLC-DPPH法共发现了灯盏花中15种抗氧化剂,并通过LC-MS数据推断了其中13种物质的结构,分别是隐绿原酸(4-CQA),异绿原酸B (1,4-DCQA),异绿原酸A (3,5-DCQA),异绿原酸C(4,5-DCQA),1-丙二酸单酰-3,5-二咖啡酰奎尼酸酯(1-Malonyl-3,5-DCQA),9-咖啡酰-2,7-脱氢-2-辛酮糖酸(9-COA),3-咖啡酰-2,7-脱氢-3-去氧-2-辛酮糖酸(3-CDOA),4,9-二咖啡酰-2,7-脱氢-3-去氧-2-辛酮糖酸(4,9-DCDOA),飞蓬酯乙(3,9-DCDOA),灯盏花苷(Erigeside Ⅰ),灯盏乙素(scutellarin),槲皮素-3-氧-葡萄糖酸苷(Quercetin-3-O-glucuronide),圣草酚-7-氧-葡萄糖醛酸苷(Eriodictyol-7-O-glucuronide)。其中9-COA、3-CDOA、4,9-DCDOA、3,9-DCDOA、Eriodictyol-7-O-glucuronide的抗氧化活性为第一次报道。异绿原酸A和灯盏乙素是灯盏花最主要的两种抗氧化剂,离线测定结果显示其自由基消除能力均强于VC。 (3)异绿原酸A和灯盏乙素在HPLC-ABTS法和HPLC-DPPH法中呈现相反的抗氧化活性顺序,而用离线法验证,在充分的反应时间后,两自由基体系中异绿原酸A的活性均大于灯盏乙素,和on-line HPLC-ABTS法的结果一致,证实了在线ABTS法更灵敏。 (4)利用离线ABTS法比较了云南鼠尾草、甘西鼠尾草、栗色鼠尾草地上部分及地下部分共6个鼠尾草样品95%乙醇提取液的抗氧化活性,他们的活性顺序是：甘西鼠尾地下部分栗色鼠尾草地上部分云南鼠尾草地下部分≈栗色鼠尾草地下部分甘西鼠尾草地上部分云南鼠尾地上部分,且均小于VC。 (5)基于HPLC-ABTS法从鼠尾草两个代表：云南鼠尾草地下部分和甘西鼠尾草地上部分中发现了13种抗氧化剂,通过LC-MS初步推断出7个物质,分别是Yunaneic acid G、丹酚酸B、11,12-di-O-methylisorosmanol、丹参酮Ⅰ、Rosmanol、丹参酮ⅡA、6-oxo-弥罗松酚。其中丹酚酸B、丹参酮Ⅰ,丹参酮ⅡA通过对照品指认。并且利用在线ABTS法测定了了其中三种物质的抗氧化活性顺序为：丹酚酸BVC丹参酮Ⅰ丹参酮ⅡA。 研究结果表明,HPLC-ABTS/DPPH是一种快速、高效的从复杂中药样品中筛选抗氧化活性成分的方法。相比HPLC-DPPH法,HPLC-ABTS法对某些化学成分具有更灵敏的