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火把梨谷胱甘肽S-转移酶基因的克隆与功能分析

王光勇  
【摘要】:农作物生长过程中经常会遇到干旱、盐碱、高温、低温、病虫害等不良环境条件的干扰,从而影响作物的生长和发育,造成减产和品质降低。随着环境的逐年恶化及人口的不断增加,对粮食需求的压力越来越大,迫切需要培育出高耐逆境胁迫的作物。干早、盐、低温等非生物逆境都会造成植物不同程度的脱水,导致植物体内产生渗透胁迫,使得ABA含量大幅度升高,进而诱导大量活性氧(reactive oxygen species, ROS)的产生。ROS可作为信号物,诱导植物产生应对逆境胁迫的防卫机制,但是过多的ROS会损伤膜脂、核酸、蛋白质等生物大分子,造成二级胁迫。谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase, GST)为植物活性氧清除相关酶系的重要成员之一,通过催化亲电底物与GSH反应,从而达到清除活性氧以及外源化合物的作用。目前已有多例转入GSTs能提高植物对逆境胁迫抵抗能力的报道。本研究从云南火把梨(Pyrus pyrifolia Nakai)中克隆得到果皮表达的PpGST的全长cDNA,并对其进行生物信息学分析,了解该基因以及其编码的蛋白的特性。接着构建该基因的植物超表达载体,使用根癌农杆菌介导法,将其转入到烟草(Nicotiana tabacum)中过量表达,最后以PpGST转基因烟草为材料进行胁迫处理,研究该基因的功能特性。本论文的研究工作及得到的主要结果如下: 1.从火把梨SSH cDNA文库中克隆出PpGST完整cDNA序列,并对其进行了生物信息学分析。 2.构建了PpGST的植物表达载体:pCAMBIA2300S-PpGST。 3.通过农杆菌介导法,获得27株PpGST转基因烟草阳性株。 4.干旱、镉和NaCl胁迫试验结果表明,供试的2株PpGST转基因烟草,在胁迫条件下相对于野生型烟草表现出较好的生长态势。在聚乙二醇6000(Polyethylene Glycol6000, PEG6000)和NaCl胁迫下,转基因烟草T1代种子相对于野生型烟草种子表现出较高的种子发芽率,此外转基因烟草幼苗表现出更高的生长量和根系长度。测定几种逆境胁迫下烟草植株中ROS和丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量,PpGST过表达可显著降低烟草在干旱、镉、NaCl胁迫下ROS的水平和膜脂氧化程度。CdCl2胁迫下PpGST转基因烟草的Cd2+含量明显低于野生型烟草,表现出对Cd2+较强的清除能力。 上述试验结果证明,PpGST过表达能提高烟草对ROS以及重金属Cd的清除能力,从而增强烟草对干旱、镉、NaCl的耐受能力。PpGST的克隆为植物抗逆境基因工程提供了基因资源。对PpGST进行功能分析,为研究PpGST的分子机制提供了一定的参考,并为PpGST在基因工程中的应用奠定一定基础。


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