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HCV在树鼩原代肝细胞中感染与转染受体辅助感染的研究

李尧  
【摘要】:丙型肝炎病毒(HCV)是丙型肝炎病的主要病原体。据1999年世界卫生组对于HCV感染情况的调查,全球感染HCV的患者约1.7-2.0亿,我国属于HCV的高度感染区,其感染者约占3.2%。高效病毒体外培养体系与合适实验动物模型的缺乏,是丙型肝炎药物与疫苗研究的主要障碍。2005年,高效的HCV病毒细胞培养体系的建立,可以经过体外培养获得高感染性的HCV病毒,使得动物模型的建立尤为紧迫。除丙型肝炎病毒的自然宿主——人和黑猩猩外,尚未发现其他自然动物对HCV易感。树鼩是一种主要分布于我国云南地区低等灵长类动物。研究发现,树鼩可被HCV患者的血清感染,但是由于HCV患者血清的来源不明、病毒滴度较低、感染不稳定、树鼩个体背景复杂等原因,丙型肝炎病毒对树鼩的感染特性未被最终阐明。 本研究以人工驯化、繁育的树鼩为实验对象,采用二步灌流、胶原酶消化法,分离、获得树鼩原代肝细胞(PTH),优化灌流液、离心速度和培养基,用单因素比较和正交实验法进行比较各优化因素之间的差别,最终以台盼蓝染色法测定获得PTH细胞数量,用MTT法测定PTH的状态。实验确定的最佳灌流液为D-Hank's、最佳离心速度为800rpm3min、600rpm3min、400rpm2min、最佳培养基配方为1×ITS、1%DMSO、200uM谷氨酰胺、0.15%牛血清白蛋白、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素、0.1uM地塞米松和WEM培养基。经过优化的PTH具有更长的生长周期和更好的生长状态,可用于受体分子转染和HCV感染实验。 为进一步提高树鼩原代肝细胞对HCV的感染性,将已成功构建可表达人CD81受体的质粒,用脂质体介导转染进入PTH,使树鼩原代肝细胞表达人的CD81分子,用PCR定性和Q-PCR的方法测定出CD81转染后最高表达量约是未转染对照细胞的234倍。最后,采用J6/JFH1-Huh7.5.1培养体系获得的病毒载量为107IU/ml以上的HCV病毒,感染高表达人CD81的PTH,荧光定量PCR法检测培养上清中HCV病毒载量,发现转染和未转染的PTH感染产出的病毒载量基本在104-105IU/ml之间,转染的细胞感染的第7天产出最高病毒载量值为106IU/ml. 综上所述,本研究以树鼩为实验动物,采用二步灌流技术得到树鼩原代肝细胞,优化了树鼩原代肝细胞的分离、培养技术,得到了生长时间更长、状态较佳的PTH。将人的CD81转染入PTH中使该细胞能高表达人的CD81,用J6/JFH-1HCV病毒感染转染的细胞,最终用Q-PCR和荧光定量PCR的技术检测转染和未转染细胞感染上清载量,未发现转染所造成HCV感染性增强或病毒增殖能力提高。 本研结果为树鼩做为丙型肝炎病毒小型动物模型,奠定了前期研究基础,并有助于HCV感染与复制的机制研究。


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