C1化合物影响拟南芥和烟草生长的生理基础和分子机理研究

【摘要】：甲醇(CH30H)、甲醛(HCHO)和甲酸(HCOOH)的代谢是高等植物的C1代谢网络中重要的组成部分。大量研究结果显示外源性施用CH30H能促进多种植物的生长,但这种刺激生长的效果受到多种外界因素的影响。作为CH30H代谢的下游产物,HCHO和HCOOH对植物均有毒害作用,并且HCHO的毒性尤为强烈。本论文首先采用叶片喷洒的方式,向盆栽拟南芥分别施用这三种C1化合物,初步探索三者对植物的生长表型、生理生化特性以及胁迫应答、C1代谢、光合作用相关基因表达的影响。HCHO作为普遍存在的环境污染物,其致癌性和致畸性已引起世界的广泛关注,在医学领域对于HCHO的毒性机理也展开了广泛的研究,但目前有关HCHO对于植物毒性机理的研究还很少,也尚未见到在全基因组水平上对于高等植物HCHO应答基因进行鉴定的相关报道。模式植物拟南芥和烟草是植物学领域两种应用最广泛的研究材料,本实验室之前的研究显示二者对于HCHO的耐受性以及代谢途径均有显著的差异。基于此,本研究分别构建HCHO胁迫拟南芥和烟草的反向抑制性消减杂交(SSH) cDNA文库,结合HCHO胁迫下拟南芥cDNA芯片分析,分别对两种植物中潜在的HCHO胁迫响应基因进行分离鉴定,以期在转录水平上阐述HCHO对拟南芥和烟草的毒性机理及其抑制两种模式植物生长机制的相同点和不同点,为提高植物HCHO抗性的基因工程提供新的侯选基因。尽管已有的一些研究提出CH30H在植物体内的可能代谢走向和机制,但目前的研究结果仍然没有归纳出CH30H在植物中的具体代谢途径。13C-NMR技术是研究代谢途径的一个强有力的工具之一,本研究使用13CH3OH标记处理拟南芥和烟草获得其13C-NMR代谢谱,对拟南芥和烟草中的CH30H代谢途径和机制进行详细的解析,并结合使用光呼吸突变体和一系列CH30H代谢相关化合物分析CH30H代谢作用及其刺激植物生长的相关性。进一步分析甲醇对两种模式植物光合碳同化及相关基因表达的影响,在代谢水平和转录水平上阐述CH30H刺激两种模式植物生长的机制。主要研究结果和结论如下： 通过叶面喷施三种C1化合物处理盆栽拟南芥发现CH30H促进其生长,并诱导多数光合作用相关基因的表达,HCHO强烈抑制其生长,同时引发造成蛋白质过氧化损伤并激活胁迫应答系统,HCOOH的毒性与HCHO相比较小,三种化合物处理对多数Cl代谢基因表达没有显著影响,但都抑制5,10-亚甲基-四氢叶酸还原酶基因的表达。 综合生理水平和转录水平的分析发现,叶绿素的大量流失造成叶片的黄化甚至白化是两种模式植物经受HCHO胁迫的一种最典型的症状。HCHO胁迫可能通过抑制多种叶绿体结构蛋白以及光合作用关键酶基因的转录水平影响植物光和作用的正常进行。甲醛胁迫引发拟南芥中的DNA损伤和蛋白质过氧化损伤,热激蛋白的上调表达是拟南芥对甲醛胁迫的积极应答机制。医学领域的研究证实在动物体内吸入HCHO能够引起膜脂过氧化和蛋白质的氧化损伤,这也是HCHO对烟草产生毒害作用的一个显著特征,这可能由烟草中HCHO的代谢能力较差引起的。热激蛋白和蛋白质合成基因的下调表达也是降低烟草对甲醛胁迫抗性的主要原因之一。甲醛对甲基化循环关键酶基因表达的抑制是烟草中甲醛毒性的重要特征,这在一方面可能影响烟草中多种激素的合成从而对其生长产生严重的抑制作用,另一方面可能也破坏膜结构的组成,从而使膜脂易被氧化损伤。HCHO抑制拟南芥和烟草中大量脱毒相关基因如CYP、GT和GST的表达,这显示对脱毒途径的抑制可能是HCHO对植物产生毒害的普遍机制。 本研究利用13C-NMR技术对拟南芥和烟草中CH30H的代谢过程与其刺激植物生长的相关性分析,并结合CH30H对两种模式植物光合碳同化及相关基因表达的影响结果分析显示,在固体MS培养条件下,拟南芥和烟草中低浓度CH30H对植物生长的促进效果最为显著,而此时13CH30H代谢代谢产生的HCOOH更倾向于进入叶酸依赖的C1代谢途径,而不是氧化为CO2进入卡尔文循环,13CH30H代谢的主要产物是[3-13C]Ser,其代谢过程与其刺激生长作用不存在显著的相关性。低浓度CH30H强烈诱导光合作用相关基因的表达并刺激光合碳同化过程是其刺激拟南芥生长的主要机制。烟草对CH30H的氧化能力比拟南芥强,烟草中不同浓度CH30H的代谢机制很相似,对光合碳同化以及光合作用相关基因表达的刺激效果也相差不大,高浓度CH30H对烟草生长的刺激作用可能被其代谢积累的HCHO和HCOOH的毒性所抵消。