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基于成分“敲出/敲入”的中药牛黄药效物质辨识模式研究

延春霞  
【摘要】:中药是几千年来中华民族通过不断实践和认识积累的宝贵财富,但中药化学成分较复杂,其中大多数药效物质基础尚不清楚。中药质量控制是实现中药现代化发展的关键,而药效物质辨识则是支撑中药质量控制的重要基石。 已有悠久药用历史的名贵中药牛黄,具有抗惊厥、抗氧化、利胆、抗炎等多种药理作用。一直以来由于天然牛黄来源有限,产量低,导致其价格昂贵。尽管科研人员研制了人工牛黄等代用品,但是代用品与天然牛黄的化学组成及成分含量差异较大,临床药效差异明显,故亟待建立能客观表征牛黄的真实质量标准,且其关键是牛黄的药效物质基础的阐明。 本研究在已有实验基础上,通过建立关联牛黄药效的体外生物活性评价模型,对牛黄的关键药效物质基础进行辨识,为后续科学合理地建立牛黄质量控制标准及研制天然牛黄代用品提供参考。实现“关联药效,量而又准”质控标准的目标。本文研究主要分为以下几个方面: 1、采用UPLC分别对10批牛黄的主要成分胆汁酸和胆红素进行了含量测定,对各牛黄样品成分的含量差异进行综合分析,结果表明:天然牛黄与人工牛黄等代用品的指标性成分含量差异明显,且不同来源的人工牛黄等代用品的指标性成分含量亦存在差异。本研究首次建立了基于UPLC-MS的牛黄化学指纹图谱,采用主成分分析法对其进行分析后发现10批牛黄样品之间存在交叉。故单纯依靠化学分析不能有效区分和鉴别不同品种、来源的牛黄样品。 2、建立了基于实时细胞分析仪xCELLigence系统的关联牛黄药效的神经细胞氧化应激性损伤模型:对其条件进行了优化,获得优化条件如下:人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞接种浓度为4×105cells/mL,损伤试剂浓度过氧化氢为0.2mM;并以细胞增殖-毒性检测试剂盒法对其结果进行佐证,细胞增殖-毒性检测试剂盒条件为:CCK-8浓度为10%,孵育时间为2h,检测波长450nm。该生物活性评价模型具有实时在线、微量、高效、操作简单等优点。 3、用所建模型对收集到的10批牛黄总提物样品的抗神经细胞氧化应激性损伤作用进行评价,结果表明:不同品种、来源的牛黄样品的活性作用存在较大差异;其中,天然牛黄总提物的活性最高,浓度约在0.03-0.5mg/mL范围内有效:酶促牛黄次之,浓度约在0.03-0.25mg/mL范围内有效;人工牛黄的作用范围存在较大差异,可能由于生产工艺不同、质控标准存在差异等人为、主观因素等导致。 4、采用偏最小二乘法对牛黄的化学指纹图谱和药效活性进行“谱—效”关系分析,初步对牛黄的药效物质进行了筛选,确定可能的药效物质为甘氨胆酸、胆酸、猪去氧胆酸及可能为甘氨脱氧胆酸或其同分异构体的未知成分。 5、使用所建生物活性评价模型,对已有敲出目标成分进行抗神经细胞氧化应激性损伤的活性评价,初步实现对牛黄活性物质的辨识。由于“谱—效”关系分析结果主要依靠数学模型等理论知识进行相关分析而来,可能会存在某些偏差,故本研究对已有敲出目标成分均进行了活性评价。结果如下:胆红素、结合胆红素、甘氨胆酸、胆酸为牛黄的主要活性物质;鹅去氧胆酸、猪去氧胆酸对过氧化氢致神经细胞氧化损伤无影响,而牛磺胆酸钠、去氧胆酸对神经细胞造成损伤。 综上所述,本文探索建立了基于实时细胞分析仪xCELLigence系统评价方法的关联牛黄药效的神经细胞氧化应激性损伤模型;以“谱-效”关系为切入点,对目标敲出成分进行活性评价,初步辨识了牛黄抗神经细胞氧化应激性损伤的关键活性物质;为中药牛黄药效物质基础的阐明和质量控制的科学建立提供了理论依据与实验支持。


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