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肺癌相关IL1R1、Galectin-3、MUC1蛋白抗体制备及夹心免疫传感器检测体系建立

范丹楠  
【摘要】:肺癌一直是世界上最常见的癌症,仅次于乳腺癌和前列腺癌的第三大常见癌症,癌症死亡中占最大比例,且预后不良。肺癌早期一般不产生明显的症状,因此大约60%的人在诊断时都已经处于疾病晚期,无法接受手术治疗。患者5年内生存率不到15%。如果能早期发现肺癌,及时进行手术切除治疗,患者术后死亡率可降低到2%。因此早期诊断对于提高肺癌患者的生存率及改善预后有至关重要的作用。肺癌的传统诊断方法主要包括影像学检查、支气管镜、病理活检等。其中影像学检查存在良恶性结节的鉴别诊断困难,病理活检需要考虑患者身体情况,且具有一定风险性,因此肿瘤标记物在癌症早期诊断与预测成为研究热点。血清肿瘤标志物是从疑似肿瘤患者的血清或血浆中检测到的生物学指标。这些指标能反应肿瘤的存在,有利于肿瘤的病理分析和发展评价。与影像检查及病理检查相比,肿瘤标志物检测方便、仪器成本低、侵犯少等优点。因此本课题研究电流型夹心免疫传感器联合检测IL1R1、Galectin-3、MUC1蛋白在肺癌患者血清中表达情况,利用该法检测成本低、制备简单、操作方便、样品体积小、快速、一次性等优点,为早期发现肺癌病人提供技术支持。主要获得以下结果:1.选取与肺癌相关的半乳糖凝集素基因(Galectin-3)、迁徙和侵袭性白介素1受体蛋白1基因(IL1R1)及MUC1粘蛋白基因(MUC1),找出其CDS序列,选取特异性基因片段,利用PCR扩增获得到IL1R1基因片段长为486bp,Galectin-3基因片段长为753bp、MUC1基因片段长为513bp。并成功构建这些基因片段的原核表达载体,转化大肠杆菌衍生菌Rosetta,进行蛋白表达纯化获得了这三种可溶性重组蛋白。采用Brand Ford法测定纯化重组蛋白浓度,测得IL1R1,Galectin-3和MUC1蛋白浓度分别为10.5μg/m L,50μg/m L和27μg/m L。2.特异性抗体的制备:将获得的重组蛋白IL1R1、Galectin-3和MUC1分别与弗氏佐剂充分研磨形成合格的油包剂,对兔进行免疫,共免疫四次后,对家兔心脏采血获得相应的特异性抗体。用Western Blot法检测表明IL1R1、Galectin-3、MUC1抗血清能够与其相应的抗原产生特异性结合,并利用琼脂糖双向免疫扩散法对IL1R1、Galectin-3、MUC1抗体进行效价分析。初步获得IL1R1、Galectin-3和MUC1抗体效价分别为1:16、1:32和1:32。3.电流型夹心免疫传感器的制备:选择以碳浆为工作电极,氯化银为参比电极,碳浆为对电极的碳浆印刷电极。依次把多壁碳纳米管/纳米金(Mw CNTs/Au NPs)、检测蛋白抗体组装到碳浆印刷电极的工作电极上,制备SPCE│Mw CNTs-Au-检测蛋白抗体电极,用牛血清蛋白BSA封闭非特异性结合位点,制备得到检测蛋白捕获抗体探针;向胶体金溶液加入抗体蛋白和过氧化氢催化酶(CAT),获得CAT纳米金标记检测蛋白的信号抗体探针。将捕获抗体探针物理吸附到工作电极后加入检测蛋白样品,由于检测蛋白抗体与结蛋白特异性结合,碳电极能快速识别并捕获样品中的检测蛋白,之后再加入检测蛋白信号抗体探针,探针上的检测蛋白抗体能快速识别结合碳电极捕获的检测蛋白,制得电流型夹心免疫传感器。信号抗体探针上的CAT酶催化加入的H_2O_2产生还原氧化反应,通过电化学分析工作站检测该反应的信号电流峰值,可快速实现对检测蛋白表达水平检测。用上述方法分别制得IL1R1,Galectin-3和MUC1三种蛋白检测的电流型夹心免疫传感器。4.肺癌患者周血肿瘤标记物的电流型夹心免疫传感器的检测:从昆明市第一人民医院收集25例肺癌患者血清样本与病理资料。利用电化学夹心免疫传感器和Western Blot两种方法检测肺癌患者周血清中IL1R1、Galectin-3、MUC1蛋白表达量。Western Blot法对25例血样都能检测出这三种蛋白,测得IL1R1、Galectin-3和MUC1蛋白的浓度范围分别为6.28-11.66 ng/m L、1.04-2.36 ng/m L和1.31-2.64 ng/m L。电流型夹心免疫传感器对25例血样也都能检测出这三种蛋白,测得IL1R1、Galectin-3和MUC1蛋白浓度范围分别是7.01-12.36 ng/m L、1.11-2.50 ng/m L和1.65-2.79 ng/m L。相同样品传感器检测的蛋白浓度约高于Western Blot法检测的浓度。两种方法检测出的浓度呈显著正相关,Person检测IL1R1、Galectin-3和MUC1相关系数分为0.672、0.913和0.865(p0.01)。两种方法检测出这些蛋白表达量与肺癌恶性程度具有一定正相关性。但Western Blot方法具有检测过程时间长、实验繁琐、试剂需求大、样品检测少等局限性,电化学免疫传感器具有灵敏度高、响应时间快、成本低、设备操作简单、一次性可大量检测等特点,具有开发应用到临床检查肿瘤标记物的价值。


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